高海拔地區血液基因組DNA提取條件優化

范東艷,杜寶中,王 蘋,全雄杰

(1.西藏大學醫學院，西藏 拉薩850000;2.吉林大學第一醫院，吉林 長春130021;3.西藏阜康醫院，西藏 拉薩850000)

全血基因組DNA是科學研究、臨床疾病分析及親子鑒定等許多研究領域不可缺少的原材料。目前，提取DNA的各類方法較多，除各實驗室有自身獨特的方法外，應用最為廣泛的還屬商品化的血液基因組提取試劑盒，不僅使用方便成本低廉且液體量較少相對污染較低。西藏自治區地處我國西南邊疆，平均海拔在3000米以上，由于地勢高而形成了特有的高原低壓低氧、寒冷干燥的環境。在高原環境中提取血液基因組可采用商品化的血液基因組提取試劑盒，但是如果按照試劑盒中說明書方法進接提取血液基因組其產量和純度很難滿足后續研究的需要。本課題組經過多次嘗試研究，摸索出了一套血液基因組試劑盒提取DNA的優化方法，該方法在高原環境下提取的DNA能夠獲得滿意的產量和純度。

1 材料與方法

1.1實驗材料

2017年5月西藏阜康醫院體檢的健康體檢者的血液樣品109份作為基因組DNA提取的材料。

1.2主要試劑與儀器

RelaxGene Blood DNA System 血液基因組DNA提取系統(非離心柱型)[天根生化科技(北京)有限公司]，其產品組成：細胞裂解液CL2×250 ml，緩沖液FG 120 ml，洗脫緩沖液TB60ml，蛋白酶K1 ml。其余試劑為分析純，水為雙蒸滅菌水。

高速臺式離心機(Sigma)；超微量紫外可見分光光度計(Thermo)。

1．3實驗分組

將109份血液樣品的每一份分為2組：實驗組(109份)和對照組(109份)。

1．4實驗方法

1．4．1 對照組按300 μl抗凝血750 μl裂解液提取DNA，具體的操作方法對照組采用RelaxGene Blood DNA System 血液基因組DNA提取系統試劑盒說明書提取方法。

實驗組按300 μl抗凝血900 μl裂解液提取DNA ，采用RelaxGene Blood DNA System 血液基因組DNA提取系統(非離心柱型)試劑盒，對實驗條件和方法進行優化和改良，其方法是：1)將抗凝血樣(2 ml血液/管)從-80℃冰箱中，室溫融化，利用移液器在樣品管中把血樣充分混勻，取300 μl血樣置于尖底離心管中并向管中加入750 μl細胞裂解液CL，顛倒混勻10次。重復2次。2)離心12 000 rpm 1 min、 棄上清，將離心管倒置于干 凈吸水濾紙上5 min，此時確保管底沉淀在管中。3)按100∶1配制FG與蛋白酶K混合液，現用現配。將混合液按照200 μl/管的量加入到已棄上清并倒置5 min的EP管內，立即渦旋混勻至無團塊。4)65 ℃水浴過夜(20 h)，最初的2 h內每10-15 min顛倒混勻2-3次，并用手指彈勻，水浴后可見溶液的顏色從紅色變為黃綠色。5)加入異丙醇150 μl，渦旋混勻至絲狀或簇狀DNA為止。6)離心12 000 rpm 5 min、棄上清將EP管倒置于干凈的吸水濾紙上、確保沉淀在EP管中、加入150 μl 70%乙醇、渦旋振蕩5 s、離心12 000 rpm 2 min棄清，再次重復加入150 μl 70%乙醇、離心棄上清后將EP管倒置于干凈的吸水濾紙上，15 min。6)加入100 μlTB緩沖液，室溫過夜(24 h)。

1．4．2 DNA濃度、純度的檢測采用紫外線分光光度法[3]。

1．5統計學方法

2 結果

2.1DNA不同濃度比例比較實驗組109份樣品中DNA濃度沒有<20 ng/μl，有13份DNA濃度在20-50 ng/μl之間，35份DNA濃度在51-80 ng/μl之間，61份樣品DNA濃度>80 ng/μl； DNA濃度比例高于對照組見表1。

表1 實驗組與對照組DNA不同濃度比例比較(ng/μL)

2.2DNA不同純度比例比較實驗組109份樣品中DNA純度OD260/OD280比值在≥1.7-<1.9之內的有105份，比值小于1.7的有3份，比值≥1.9的有1份， DNA純度比例高于對照組見表2。

表2 實驗組與對照組DNA不同純度比例比較(OD260/OD280)

3 討論

臨床醫學疾病研究、分子生物學、遺傳學等流行病學的調查研究都離不開高純度、高分子量的血液基因組(DNA)[1-3]。現今，DNA的提取方法較多，也有多種品牌的提取試劑盒可供選擇使用。但青藏高原平均海拔較高，如果使用常規化學方法提取DNA因使用有機溶劑量較多不但運輸不便而且也會對環境造成污染。最恰當的方法就是利用血液基因組DNA提取試劑盒提取DNA，不但操作簡便而且有機溶劑的使用量也非常小，并可將獲得的DNA直接用于下游實驗[4]。西藏地區地處高原大氣壓低于平原地區且干燥低溫對DNA的提取有一定的影響，本課題組在平原地區采用天根RelaxGene Blood DNA System 血液基因組DNA提取系統試劑盒提取DNA，按照說明書方法操作，獲得的DNA的濃度和純度均能滿足下游實驗的需求，但在西藏大學醫學院分子生物學實驗室(拉薩市平均海拔3600米)采用說明書方法提取DNA時無論是純度還是濃度均無法滿足下游實驗要求所以經過多次實驗總結提出了天根DNA提取系統在高原地區使用的改良方案：(1)在300微升抗凝血中加入細胞裂解液CL由原來的750 μl改為800 μl；(2)加入蛋白酶K FG混合液后65 ℃水浴由原來的10 min改為過夜(20 h)；(3)將說明書上的加入200 μl TB緩沖液改為100 μl，65 ℃水浴1 h改為過夜(24 h)。

在高原環境提取DNA的過程中，首先將-80℃保存的抗凝血室溫融化后按照改良方案細胞裂解液使用量為血液的3倍，顛倒混勻10次使DNA分離出來[5,6]；加入蛋白酶K和FG混合液后水浴20 h,樣品溶液透明，推斷由于環境因素導致裂解時間延長；加入TB洗脫液后水浴24 h后采用紫外分光光度法檢測DNA濃度和純度。根據文獻報道DNA純度判斷標準：純DNA，其OD260/OD280比值范圍應為1．7-1．9；OD260/OD280比值>1．9，表明有RNA污染；OD260/OD280比值<1.6，表明有蛋白質等污染[7]。實驗組109份樣品中35份DNA濃度在51-80 ng/μl之間，61份樣品DNA濃度>80 ng/μl； DNA純度OD260/OD280比值在≥1.7-<1.9之內的有105份，比值小于1.7的有3份，比值≥1.9的有1份， DNA濃度和純度比例均高于對照組。

采用改良方法在高原地區提取的DNA無論是完整性還是濃度純度均能保證后續實驗研究的需要同時適合臨床研究及檢測應用。

作者簡介：范東艷(1973-)，女，博士,博士后,副教授,主要從事低氧環境對機體健康影響研究。

參考文獻：

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[7]段 瑩，于衛建．-40 ℃條 件 下 儲 存 不 同 時 間 的 全 血 對 提 取DNA濃度的影響[J]．中國輸血雜志，2011，24(11)：973．