白刺對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞的抑制作用

王亞峰，謝親建，丁曉煜，孫曉剛，羅淑平，賀葵邦

1青海省人民醫(yī)院藥劑科，青海 西寧 810000；2武警甘肅省總隊(duì)醫(yī)院；3中國(guó)人民解放軍蘭州總醫(yī)院

白刺是蒺藜科白刺屬的灌木，分枝多而密集，呈叢生狀，具有較強(qiáng)的固沙阻沙能力，而西北屬氣候條件惡劣，水資源缺乏，風(fēng)沙彌漫遍地的寬闊地帶，白刺是一種生長(zhǎng)在沙漠的耐寒植物，它的果實(shí)光滑圓胖，如同微型圣女果，在陜甘蒙地區(qū)又被稱為“酸胖”，性溫、味甘、微堿酸，具有調(diào)經(jīng)活血，消食健胃的功效，用于治療肺病、胃病、心熱痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)、消化不良等［1］。近年來(lái)有研究［2］表明白刺果的稀有金屬為鉻、鋅、鐵、錳、硒等微量元素和18種氨基酸，另外它所含的總黃酮及其衍生物是抗炎、降壓、擴(kuò)張冠狀血管、抗癌的有效成分［3］。因此，本研究從細(xì)胞水平探討白刺果實(shí)能否有效抑制胃癌，為以后研究白刺治療癌癥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)昆明種小鼠50只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(甘)2013-0002，購(gòu)自蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量(18±2)g，雌雄各半。

1.2 儀器與試劑 Sartorius分析天平(SARTORIUS-BT23S)；KH-5200B超聲清洗器(昆山禾木超聲儀器有限公司)；Thermo CO2培養(yǎng)箱(thermoscientific公司)；Multiskan Spectrum酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Scientific公司)。小牛血清(四季青)；RPMI1640 培養(yǎng)基(美國(guó) Solarbio 公司)；MGC-803細(xì)胞株(青海省人民醫(yī)院惠贈(zèng))；5-FU(5-氟尿嘧啶，上海旭東海普藥業(yè)有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 白刺果液的制備 白刺果500 g(來(lái)自民勤縣騰格里沙漠，經(jīng)蘭州大學(xué)生藥學(xué)教研室馬教授鑒定），除去雜質(zhì)和霉變果實(shí)，清水沖洗、曬干；放入圓底燒瓶煎煮，加入純水2 500 mL，煎煮2～3次，1～1.5 h/次，過(guò)濾，合并濾液，濃縮至比重為1.025～1.030 g/mL，待用。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)與MTT檢測(cè) 將凍存的胃癌MGC-803細(xì)胞株在37℃水浴中迅速融化，加入2 mL RPMI1640吹打后放入15mL玻璃離心管中，800rpm離心，棄去上清液，在含有10%新生小牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中，在37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，整個(gè)過(guò)程在無(wú)菌操作間進(jìn)行。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌MGC-803細(xì)胞，用含10%小牛血清的RPM1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至1.0×105/mL，接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL。待細(xì)胞貼壁后分別加入不同濃度(25，50，100，200 mg/mL)的白刺溶液，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。分別培養(yǎng)24、48、72小時(shí)后每孔加入 5 mg/mL的噻唑藍(lán)(MTT)試劑10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，棄上清液，每孔加入DMSO 100 μL，震蕩至結(jié)晶溶解后，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀以570 nm測(cè)量波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度(A)，按以下公式計(jì)算：

抑制率(%)=(對(duì)照組-給藥組)／對(duì)照組

1.3.3 PI檢測(cè)細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期胃癌MGC-803細(xì)胞，調(diào)整至每毫升2.0×105個(gè)細(xì)胞，接種于6孔板，每孔3 mL。待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的白刺溶液，每孔加入藥物后終體積為1 000 μL。培養(yǎng)48小時(shí)后，消化收集細(xì)胞，800 rpm離心5分鐘，棄上清。預(yù)冷磷酸緩沖鹽溶液(PBS)重懸細(xì)胞，離心洗滌3次，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇4℃固定過(guò)夜。上機(jī)前用預(yù)冷的PBS洗滌，加入PI染色液(含 RNA 酶 5 mg/mL)，終濃度 500 μg/mL，避光染色15分鐘，300目尼龍網(wǎng)過(guò)濾后上流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞DNA含量的變化，每個(gè)樣本隨機(jī)分析10 000個(gè) /mL。

1.3.4瑞氏——吉姆薩染色細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的胃癌細(xì)胞，計(jì)數(shù)、稀釋，最終細(xì)胞密度為2×106個(gè)/mL，接種于6孔板上，每孔加3 mL的細(xì)胞，接種24小時(shí)后，按照給藥濃度分別為200、100、50 mg/mL 3組和空白對(duì)照組，每孔分加300 μL的白刺溶液，空白對(duì)照組用等體積培養(yǎng)液，培養(yǎng)48小時(shí)后。PBS洗滌2遍，取少量細(xì)胞離心涂片，瑞氏——吉姆薩染色，光鏡下觀察形態(tài)。1.3.5 毒性試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)［4-6］方法觀察白刺對(duì)昆明種小鼠的毒性試驗(yàn)。將昆明種小鼠20只分為高劑量組、空白對(duì)照組，每組10只。2周后用斷頭法處死小鼠，用病理觀察方法觀察小鼠臟器。

2 結(jié)果

2.1 白刺溶液對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞的抑制作用 不同濃度白刺溶液作用于胃癌MGC-803細(xì)胞24、48、72小時(shí)均可抑制細(xì)胞增殖。隨著藥物濃度和作用時(shí)間的增加，該藥的抑制作用逐漸增強(qiáng)，但作用48～72小時(shí)時(shí)抑制率的增幅逐漸減小，100～200 mg/mL作用72小時(shí)的抑制率相近，見(jiàn)圖1。

圖1 不同時(shí)間白刺溶液對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞的抑制率

2.2 白刺溶液對(duì)胃癌細(xì)胞周期的影響 白刺溶液對(duì)胃癌細(xì)胞周期的影響結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 白刺溶液對(duì)胃癌細(xì)胞周期的影響

2.3 白刺溶液對(duì)胃癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響 光學(xué)顯微鏡下對(duì)照組MGC-803細(xì)胞分布均勻，大小一致，加入相同體積的RPMI1640作用細(xì)胞48小時(shí)，可見(jiàn)細(xì)胞無(wú)變化。加入50mg/mL白刺溶液后MGC-803細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞不規(guī)則，細(xì)胞膜周邊形成小泡，處于凋亡小體的形成中。加入100mg/mL的白刺溶液后MGC-803細(xì)胞體積連接緊密不規(guī)則，細(xì)胞膜周邊有的形成小泡，處于形成凋亡小體的過(guò)程中。加入200 mg/mL的白刺溶液作用于MGC-803細(xì)胞

圖3 白刺溶液對(duì)胃癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)(HE×200)

圖5 肝臟(HE×40)

圖7 肺臟(HE×40)

3 討論

胃癌是一種常見(jiàn)腫瘤，近年來(lái)調(diào)查表明在水土與氣候條件惡劣的環(huán)境中，胃癌的發(fā)病率增高，胃癌治療的主要手段是切除，但是復(fù)發(fā)率較高。因此，為了防止腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，延長(zhǎng)患者的生存時(shí)間和提高患者的生活質(zhì)量，減輕患者痛苦，學(xué)者們不斷尋找治療癌癥的各種藥物。近年來(lái)在中醫(yī)傳48小時(shí)，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞出現(xiàn)破裂，不規(guī)則程度增大，有可能逐漸向凋亡狀態(tài)過(guò)渡，見(jiàn)圖3。

圖4 心臟(HE×40)

圖6 脾臟(HE×40)

圖8 腎臟(HE×40)

2.4 白刺溶液對(duì)小鼠臟器的影響 光鏡下心肌細(xì)胞均勻完整，未發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞及內(nèi)膜纖維化；小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞排列整齊，無(wú)壞死狀態(tài)，無(wú)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，匯管區(qū)有輕微的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；脾、肺、腎臟與空白對(duì)照組相比，無(wú)明顯變化。由此可知，白刺溶液對(duì)小鼠的臟器沒(méi)有明顯不良影響，見(jiàn)圖4—8。統(tǒng)理論的指導(dǎo)下，用中藥來(lái)治療癌癥受到國(guó)內(nèi)外重視［7-8］。本研究發(fā)現(xiàn)白刺果對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞具有增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。從圖1—2可知，隨著時(shí)間和藥物濃度的增加，抑制率逐漸增大，但是當(dāng)白刺果的濃度增大到200 mg/mL時(shí)，抑制率逐漸處于平衡狀態(tài)。從形態(tài)學(xué)變化可知：細(xì)胞出現(xiàn)不規(guī)則形態(tài)，細(xì)胞膜周邊形成小泡，處于凋亡小體的形成期，隨著濃度的增大，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞出現(xiàn)破裂，不規(guī)則程度增大，有可能逐漸向凋亡的狀態(tài)過(guò)渡；從病理學(xué)角度可知，未見(jiàn)該藥對(duì)小鼠臟器的損傷作用。

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