深圳地區孕婦定植型B群鏈球菌流行病學特征

聶署萍，成子賢，王 瓊，范菲楠，蕭曉友，陸學東

(中山大學附屬第八醫院，深圳 518033)

B群鏈球菌(group Bstreptococcus, GBS)是一種定植在人類下消化道及泌尿生殖道的細菌，健康人群帶菌率為15%～35% ，也是導致圍產期母親及新生兒嚴重感染的重要致病菌之一[1-2]。在圍產期，孕婦陰道定植的GBS可以通過產道上行擴散感染子宮和胎膜，引起胎膜早破、早產、產褥感染、產后出血等多種產科并發癥。在分娩期，細菌可由陰道逆行至羊水，胎兒在產程中吞咽或吸入GBS 感染的羊水，導致新生兒肺炎、敗血癥和腦膜炎等嚴重侵襲型感染，病死率高達50%[3]。GBS編碼很多毒力因子，包括莢膜多糖、表面α-樣蛋白(α-like protein，Alp)和菌毛等，不僅在GBS的致病機制中發揮著重要作用，還是疫苗研發的重要靶點[4-6]。青霉素是目前臨床預防和治療GBS感染的一線藥物，然而對青霉素敏感性降低的菌株已有報道[7]。克林霉素和紅霉素推薦用于治療青霉素過敏人群的GBS感染，但由于其耐藥水平的不斷上升，能否繼續作為抗GBS感染二線藥物受到廣泛質疑[8-11]。國內有關孕婦定植GBS流行情況的研究少見[2,12-13]。監測本地區孕婦定植GBS的血清型、毒力因子分布和耐藥現狀對圍產期孕婦和新生兒GBS感染的預防、控制及疫苗的研發極其重要，現將檢測結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 收集2015年10月—2016年9月中山大學附屬第八醫院(深圳福田)、深圳市羅湖區人民醫院和光明新區人民醫院3所醫院送檢的孕婦GBS產前篩查陽性菌株56株。

1.2 菌種培養及鑒定 GBS采用哥倫比亞瓊脂平板35°C在5% CO2的環境中培養18～24 h。菌種鑒定采用VITEK 2 Compact全自動微生物鑒定儀結合CAMP試驗進行。

1.3 GBS莢膜血清學分型 參考文獻[14]，用多重聚合酶鏈反應(PCR)方法(QIAGEN公司)檢測GBS莢膜血清型。菌株DNA抽提采用北京全式金細菌基因組抽提試劑盒，嚴格按照說明書進行操作。PCR擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠120 V電泳120 min 后，經凝膠成像系統觀察結果。

1.4 GBS毒力因子檢測 GBS菌體表面蛋白和菌毛蛋白檢測：參考文獻[15-16]，用多重PCR法檢測GBSAlp基因(bca、eps、rib、alp2/3及alp4)和菌毛基因PI-I、PI-2a及PI-2b。直接根據PCR擴增片斷大小判斷目的基因存在與否。

1.5 GBS藥敏試驗及耐藥基因檢測 嚴格按照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)2015年標準，采用K-B紙片擴散法進行藥敏試驗。藥敏紙片購自法國Oxide公司：青霉素G、四環素、紅霉素、克林霉素、氯霉素以及左氧氟沙星。藥敏培養基為含5%綿羊血Mueller-Hinton瓊脂(購于安圖生物)。采用雙紙片擴散法(D試驗)檢測GBS對紅霉素及克林霉素耐藥表型，包括：對大環內酯-林可酰胺-鏈陽菌素B結構性耐藥(constitutive macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance，cMLSB)，即紅霉素和克林霉素均耐藥；誘導性耐藥(inducible MLSB resistance，iMLSB) 即紅霉素耐藥，靠近紅霉素紙片一側的克林霉素抑菌環出現“截平”現象，即D試驗陽性；大環內脂類耐藥型(macrolide resistance phenotype, M) 即紅霉素耐藥，克林霉素敏感，靠近紅霉素紙片的一側克林霉素抑菌環未出現“截平”現象，即D試驗陰性[17]。GBS紅霉素和四環素耐藥基因檢測：參考文獻[18]，用多重PCR法檢測紅霉素耐藥基因ermA、ermB、mefA/E，以及四環素耐藥基因tetM、tetO、tetK及tetL，根據擴增片斷大小判斷耐藥基因有無。

1.6 統計學分析 應用SPSS 20.0 統計軟件進行數據處理。采用Fisher精確檢驗比較毒力因子和耐藥基因在不同莢膜血清型中的分布差異，P≤0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GBS的血清分型與毒力因子分布 56株無乳鏈球菌共檢測出5種血清型，包括Ia、Ib、II、Ⅲ和V。其中Ia型6株(10.7%)，Ib型8株(14.3%)，II型2株(3.6%)，Ⅲ型34株(60.7%)，V型6株(10.7%)。部分菌株莢膜血清分型多重PCR電泳圖見圖1。除3株細菌外，其余53株細菌檢出alp基因，其中以rib為主，占46.4%，eps、alp2/3 及bca檢出率分別為25.0%、8.9%和14.3%，未檢出alp4基因。所有菌株均檢出至少一種菌毛基因，基因型以PI-2a+PI-1和PI-2b型為主，分別占37.5%、41.07%。表面蛋白基因和菌毛基因在各血清型中的分布見表1。部分血清型與特異表面蛋白及菌毛基因有明顯相關性，如血清型Ia與eps、Ib與bca、III與rib、V與alp2/3，血清型Ib與PI-2a、III與PI-2b及V與PI-2a+PI-1(均P<0.05)。

M:DNA marker；-：陰性對照；其余為不同血清型的GBS

Figure1Multiplex PCR electrophoresis map of partial GBS strains with different capsule serotyps

2.2 藥敏試驗及耐藥基因檢測結果 56株GBS對青霉素全部敏感，對氯霉素、左氧氟沙星、紅霉素、克林霉素、四環素有不同程度的耐藥，耐藥率分別為14.3%、23.2%、75.0%、67.9%及85.7%。42株紅霉素耐藥的GBS中包括36株cMLSB，4株M型及2株iMLSB表型。紅霉素耐藥菌株中耐藥基因ermB的檢出率最高，約88.1%，單獨存在或與mefA/E共存，未檢出ermA。V型血清型中有1株紅霉素誘導性耐藥菌株耐藥基因檢測均為陰性，可能存在其他耐藥機制。48株四環素耐藥菌株中tetM ，tetO及tetL檢出率分別為87.5%、64.6%及6.25%。不同血清型GBS分布見表2。部分耐藥基因與血清型有明顯相關性，如血清型Ib與ermB、III與tetM+tetO(均P<0.05)。

表1 56株不同血清型GBS表面蛋白及菌毛蛋白基因分布(株)

表256株不同血清型GBS紅霉素和四環素耐藥的表型、基因型分布

Table2Distribution of erythromycin and tetracycline resistance phenotypes and genotypes of 56 GBS strains with different serotypes

血清型菌株數紅霉素耐藥菌株數表型(菌株數)基因型(菌株數)四環素耐藥菌株數基因型(菌株數)Ⅰa63M(2)、cMLSB(1)mefA/E(2)、ermB(1)6tetM(4)、tetM+tetO(2)Ⅰb87iMLSB(1)、cMLSB(6)mefA/E+ermB(1)、ermB(6)6tetM(2)、tetO(2)、tetM+tetO(2)Ⅱ21cMLSB(1)mefA/E+ermB(1)1tetM(1)Ⅲ3425M(2)、cMLSB(23)mefA/E(2)、mefA/E+ermB(12)、ermB(11)30tetM(2)、tetO(4)、tetM+tetO(21)、tetM+tetL(3)Ⅴ66iMLSB(1)、cMLSB(5)mefA/E+ermB(2)、ermB(3)5tetM(5)

3 討論

GBS是定植在健康女性陰道中的正常菌群之一，我國孕婦的帶菌率約為5%～15%[12-13]。GBS可以通過產道上行擴散感染子宮和胎膜，使孕婦發生晚期流產、早產、胎膜早破，還可引起絨毛羊膜炎、產褥感染等。分娩期帶菌孕婦則易在生產過程中將GBS 傳染給新生兒，引起新生兒肺炎、腦膜炎和敗血癥等嚴重侵襲性感染[1-3]。二十世紀90年代初發達國家推行的GBS產前篩查及分娩期預防性使用抗菌藥物，有效減低了圍產期孕婦和新生兒GBS感染的發病率和病死率，但由于各種原因這些措施在我國還未廣泛推廣[1,19-21]。

GBS編碼很多與致病力相關的毒力因子，其中莢膜多糖能幫助細菌產生免疫逃逸，促進細菌的定植或侵襲，已成為疫苗研究的主要靶點。根據莢膜多糖抗原特異性的不同，GBS被分為10個血清型，包括Ia、Ib及II-IX，其中與新生兒侵襲性感染相關的血清型主要為Ia、II、III及V型[1,4]。孕婦定植GBS的血清型在不同國家和地區分布不同，如美國及部分歐洲國家主要為Ia、II、III及V型，VI-IX罕見，而馬來西亞主要為VI、VII及III型，非洲加蓬81%的孕婦定植GBS血清型為V、III及Ib[22-24]。本地區的研究結果與我國北京地區相似，以III、Ia、V及 Ib等血清型為主[13]。目前，正在研發的覆蓋5種血清型(Ia、Ib、II、III及V)的莢膜結合疫苗，如果將來在本地區投入使用能很好的預防新生兒GBS感染[4]。

此外，GBS Alp和菌毛也是重要的毒力因子及疫苗靶點。Alp由5個不同等位基因alpha-C、epsilon、alp2/3、rib及alp4編碼，能介導細菌對宮頸上皮細胞的侵襲。除3株細菌外，本研究中其余53株GBS均檢出一種alp基因，以rib為主，約46.4%，eps、alp2/3及bca的檢出率分別為25.0%、8.9%和14.3%，未檢出alp4。本研究還發現GBS的alp基因與特定的血清型有明顯相關性，如血清型Ia與esp、Ib與bca、III與rib、V型與alp2/3等，而馬來西亞Eskandarian等[23]報道rib與Ia、VI、II及III型相關。北京地區報道V型與alp2/3、III與rib、Ia與eps及Ib型與alp2/3有明顯相關性[13]。菌毛樣結構參與細菌對宿主細胞的黏附和定植，根據編碼菌毛的等位基因的不同，被分為三型：PI-1、PI-2a及PI-2b，每株細菌至少含有其中一型[6.16]。本研究中所有菌株均檢出至少一型菌毛，菌毛基因型以PI-2a+PI-1和PI-2b型為主，分別占37.5%和41.07%；菌毛類型與特異血清型分布也有明顯相關性，如血清型Ib與PI-2a、III型與PI-2b、V型與PI-2a+PI-1，而Eskandarian等[23]報道血清型III與PI+PI-2a、Ia型與PI-2a有明顯相關性，表明不同地區Alp和菌毛的分布有明顯差異。因此，了解本地區孕婦定植GBS毒力因子分布及流行情況對有效預防圍產期孕婦和新生兒的侵襲性疾病有重要意義。

青霉素是目前臨床預防和治療GBS感染的一線藥物，然而對青霉素敏感性降低的菌株已有報道[7]。克林霉素和紅霉素推薦用于治療青霉素過敏人群的GBS感染，但由于其耐藥水平的不斷上升，克林霉素和紅霉素能否繼續作為抗GBS感染二線藥物受到廣泛質疑[8-9]。GBS對大環內酯類抗生素耐藥的主要機制是由erm基因介導的核糖體靶位點甲基化修飾，從而引起的細菌MLSB交叉耐藥。此外，GBS對紅霉素的耐藥機制還包括mefA/E基因介導的外排作用，導致細菌對14、15元大環內酯耐藥(M型)。細菌對四環素的耐藥機制通常由tetM或tetO基因介導，且與大環內酯類耐藥基因位于同一可移動元件上[17-18]。本研究藥敏試驗結果顯示，所有細菌對青霉素皆敏感，表明青霉素仍可作為治療和預防GBS感染的一線藥物。與其他報道[23-24]相似，本地區GBS對四環素有很高的耐藥率(85.7%)，耐藥基因主要為tetM 、tetO。但本地區GBS對紅霉素和克林霉素的耐藥率高于其他地區(馬來西亞紅霉素耐藥率為23.3 %，克林霉素為17.5%)[23]。因此，建議對青霉素過敏的孕婦選用紅霉素或克林霉素進行抗GBS治療之前，應先進行藥敏試驗再合理選擇抗菌藥物。42株紅霉素耐藥的GBS中包括36株cMLSB、4株M型及2株iMLSB表型。紅霉素耐藥菌株中耐藥基因ermB的檢出率最高，約88.1%，單獨存在或與mefA/E共存，未檢出ermA。部分血清型與特異耐藥基因有明顯相關性，如血清型Ib與ermB、III型與tetM+tetO。

綜上所述，本研究通過了解本地區孕婦定植的GBS莢膜血清型及主要毒力因子分布，監測GBS對不同抗菌藥物的耐藥情況并研究其相關的耐藥機制，為GBS疫苗的研發，感染性疾病的預防控制及治療提供理論基礎。但本研究范圍小，樣本數不足，一定程度上影響GBS流行病學研究結果的完整性。

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