萬古霉素和非達霉素對艱難梭菌體外抗菌活性的穩(wěn)定性

趙杏珍，趙建宏，魏宏蓮，楊 靖，李志榮，強翠欣，李茹鑫,2，王曉明，趙寶鑫，翟 宇

(1 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，河北 石家莊 050000； 2 河北省臨床檢驗中心，河北 石家莊 050000)

艱難梭菌是一種專性厭氧革蘭陽性產(chǎn)氣莢膜梭菌，約15%～39%抗菌藥物相關(guān)性腹瀉(antibiotic-associated diarrhea，AAD) 由艱難梭菌感染(Clostridiumdifficile，CDI)引起[1]，感染癥狀可由輕度腹瀉到重度假膜性結(jié)腸炎，嚴重時可引起死亡[2]。艱難梭菌在健康成人中的定植率約5.5%，在健康兒童中定植率則高達13.6%[3]。2004年以來高產(chǎn)毒艱難梭菌流行株(NAP1/BI/027)在歐美國家的暴發(fā)流行更引起了特別關(guān)注。在美國，艱難梭菌已經(jīng)逐漸取代耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)成為醫(yī)療保健相關(guān)性感染(healthcare-associated infection，HAI)的首要病原菌[4]。

2014年歐洲臨床微生物學(xué)會和傳染病學(xué)會發(fā)布的艱難梭菌感染(CDI)的更新治療指南指出，輕度CDI患者建議口服甲硝唑治療，重度CDI患者則建議口服萬古霉素治療，非達霉素可用作輕度和重度CDI患者的備選藥物，對于治療后首次復(fù)發(fā)或多次復(fù)發(fā)的CDI患者，推薦使用非達霉素作為治療藥物[5]。早在1994年甲硝唑就開始用于治療CDI，但是，近年來甲硝唑治療失敗的報道有所增加[6-8]。萬古霉素用于治療首次感染的CDI十分有效。非達霉素是專門用于治療CDI的新型藥物，具有對腸道菌群影響小，復(fù)發(fā)率低等優(yōu)點[9]。因此，萬古霉素和非達霉素在CDI治療中深受臨床醫(yī)生的歡迎。迄今為止，關(guān)于艱難梭菌對以上兩種藥物耐藥的報道非常少見，但是，在抗菌藥物壓力下導(dǎo)致的細菌耐藥問題依然是不可忽視的。本研究首次采用多步誘導(dǎo)法對河北地區(qū)15株臨床分離艱難梭菌和5株標(biāo)準(zhǔn)菌株進行誘導(dǎo)試驗，并采用瓊脂稀釋法測定誘導(dǎo)前后艱難梭菌對萬古霉素和非達霉素的MIC值，以期檢測萬古霉素和非達霉素對艱難梭菌體外抗菌活性的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 20株艱難梭菌均來自河北省醫(yī)學(xué)微生物保藏庫(Hebei Provincial Bank for Medical Culture Collection，HBMCC)。15株臨床分離的菌株的核糖體分型按本實驗室統(tǒng)一命名，其中HB1/RT001型2株，HB5/RT017型3株，HB6/RT012型3株，HB3型3株，HB24型1株，HB25型3株。HB1、HB5、HB6分別對應(yīng)核糖體分型的國際命名RT001、RT017、RT012。5株標(biāo)準(zhǔn)菌株分別是ATCC 700057、ATCC 1382、ATCC 9689、ATCC 43598和ATCC 1870，購自英國OXOID公司。所有菌株均通過VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)，Microflex LT基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀和16S rDNA測序鑒定。

1.2 試劑與儀器 非達霉素由華北制藥股份有限公司提供(批號20131001)；萬古霉素購自中國藥品生物制品鑒定所(批號200301)；艱難梭菌拉氧頭孢諾氟沙星(CDMN)基礎(chǔ)瓊脂和添加劑購自英國OXOID公司；無菌脫纖維羊血購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；DM2000、100bp ladder、Es Taq MasterMix(含染料)購自北京康為世紀(jì)科技有限公司；維生素K、瓊脂糖、Goldview、PRB等引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司；布魯氏肉湯、布魯氏瓊脂均購自美國BD公司；氯化血紅素購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；氫氧化鈉購自天津市大陸化學(xué)試劑廠；超低溫冰箱購自海爾公司；生物安全柜購自上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；全自動高壓蒸汽滅菌儀購自日本ALP公司；精密分析天平購自日本A&D公司；高速冷凍離心機購自美國Thermo公司；厭氧培養(yǎng)系統(tǒng)購自廣州尤德公司；多點接種儀購自日本佐久間制作所；比濁儀購自法國生物梅里埃公司；VITEK 2 Compact全自動微生物分析系統(tǒng)購自法國生物梅里埃公司；Microflex LT基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀購自德國Bruker Daltonics公司；16S rDNA測序由生工生物工程有限公司完成。

1.3 藥敏試驗 采用瓊脂稀釋法檢測20株艱難梭菌的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)，藥敏方法及判讀標(biāo)準(zhǔn)參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)推薦的《厭氧菌藥物敏感性試驗方法》[10]。萬古霉素耐藥折點參考歐洲抗菌藥物敏感性試驗委員會(European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST)標(biāo)準(zhǔn)[11]：萬古霉素>2 μg/mL。對非達霉素的耐藥折點目前尚無確定數(shù)據(jù)。依據(jù)臨床三期試驗數(shù)據(jù)，艱難梭菌對非達霉素的MIC集中在0.25 μg/mL[12]。質(zhì)控菌株為ATCC 700057。

1.4 體外多步誘導(dǎo)試驗 采用瓊脂稀釋法檢測菌株的初始MIC值，用于計算誘導(dǎo)時所需的藥物濃度，將冷凍的艱難梭菌在強化布魯氏血平板上傳代兩次后，接種到分別含有萬古霉素和非達霉素藥物濃度為1/2倍MIC(各個菌株的初始MIC值)的強化布魯氏血瓊脂平板上，37℃厭氧環(huán)境下連續(xù)傳代10次，并在第10次傳代后對20株艱難梭菌進行藥敏試驗檢測MIC值；然后將藥物濃度提升到1倍MIC繼續(xù)傳代10次，并在第20次傳代后對誘導(dǎo)的菌株再次進行藥敏試驗檢測MIC值；最后比較所有菌株初始MIC值和誘導(dǎo)20代后MIC值。為了保證MIC結(jié)果的穩(wěn)定性，每次在測定艱難梭菌MIC值之前，將誘導(dǎo)后的菌株在不含抗生素的布魯氏血瓊脂培養(yǎng)基中傳代3次，見圖1。

圖1 檢測菌落傳代培養(yǎng)流程

2 結(jié)果

20株艱難梭菌菌株體外誘導(dǎo)前對萬古霉素的MIC范圍在0.125～0.50 μg/mL之間，誘導(dǎo)20代后MIC范圍在0.50～2.00 μg/mL之間；其中3株菌的MIC出現(xiàn)4倍增長，4株菌的MIC值不變，13株菌的MIC出現(xiàn)2倍增長；所有菌株對萬古霉素均敏感。20株艱難梭菌菌株體外誘導(dǎo)前對非達霉素的MIC范圍在0.015～0.50 μg/mL之間，誘導(dǎo)后MIC范圍在0.0075～0.50 μg/mL；其中13株菌的MIC值基本不變或出現(xiàn)2倍增長，3株菌的MIC值出現(xiàn)8倍增長，4株菌的MIC值出現(xiàn)4倍增長。此外，艱難梭菌對非達霉素的MIC值均小于或等于萬古霉素，且未發(fā)現(xiàn)各菌株誘導(dǎo)前后MIC值的變化與核糖體型別有關(guān)。各菌株誘導(dǎo)前后的MIC值見表1。

3 討論

本研究通過體外誘導(dǎo)的方法分析萬古霉素和非達霉素對15株臨床分離艱難梭菌及5株標(biāo)準(zhǔn)菌株體外抗菌活性的穩(wěn)定性。研究結(jié)果顯示20株艱難梭菌對萬古霉素的MIC范圍在0.125～0.50 μg/mL之間(萬古霉素耐藥折點為>2 μg/mL)；所有菌株對萬古霉素均敏感，且誘導(dǎo)20代后菌株MIC依然在0.50～2.00 μg/mL之間，其中3株菌的MIC出現(xiàn)4倍增長，4株菌的MIC值不變，13株菌的MIC出現(xiàn)2倍增長，MIC雖然有微小變化，但總體上誘導(dǎo)前后所有菌株對萬古霉素的敏感性變化不大，這也說明萬古霉素體外抗艱難梭菌活性穩(wěn)定性較好，萬古霉素雖然用于治療CDI的時間較長，但不易出現(xiàn)繼發(fā)耐藥。此外，本次研究雖未出現(xiàn)萬古霉素耐藥株，但是有1株菌對萬古霉素敏感性略降低(MIC=2.00 μg/mL)，今后在臨床應(yīng)用中應(yīng)密切關(guān)注艱難梭菌對萬古霉素的MIC值，防止出現(xiàn)萬古霉素耐藥。 迄今為止，也曾有一些文獻報道過對萬古霉素敏感性下降的艱難梭菌，但數(shù)量十分有限。如2013年中國Dong等[13]分離到2株萬古霉素敏感性下降株(MIC值為8 μg/mL)；臺灣地區(qū)Chia等[14]報道了5株敏感性下降株(MIC>2 μg/mL)；伊朗Goudarzi等[15]報道2株MIC值為4 μg/mL的菌株；2016年Leeds等[16]通過體外誘導(dǎo)獲取了2株萬古霉素耐藥株(MIC值為16 μg/mL)，同時還通過基因測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了3個突變位點，包括MurG(參與肽聚糖的合成)108位上脯氨酸突變?yōu)榱涟彼?P108L)、rpoC(編碼β/亞基)上天冬氨酸突變?yōu)槔野彼?D244Y)和CD3659上谷氨酸突變?yōu)榻K止密碼子(E327stop)。萬古霉素是糖肽類抗生素，主要通過干擾細菌細胞壁結(jié)構(gòu)中的肽聚糖起到殺滅作用，因此，MurG上的突變可能與耐藥相關(guān)，但是MurG突變是否介導(dǎo)耐藥，以及介導(dǎo)耐藥后產(chǎn)生的適應(yīng)性代價如何尚無定論。而rpoC和CD3659的突變并不涉及萬古霉素的作用機制，其與萬古霉素的耐藥是否相關(guān)還有待進一步的研究驗證。

表1萬古霉素和非達霉素對艱難梭菌體外誘導(dǎo)前后的藥敏結(jié)果(μg/mL)

Table1Antimicrobial susceptibility testing results ofC.difficilebefore and after in vitro induced by vancomycin and amphotericin (μg/mL)

菌株萬古霉素初始MIC第一次誘導(dǎo)后MIC第二次誘導(dǎo)后MIC非達霉素初始MIC第一次誘導(dǎo)后MIC第二次誘導(dǎo)后MICHB1(RT001) 2011092700250.250.500.500.030.030.0075 2017030810470.500.501.000.500.500.50 ATCC96890.250.500.500.0150.0150.0075HB5(RT017) 2017030810480.500.500.500.1250.06250.50 2017030810490.500.250.500.030.06250.03 2010110500090.1250.500.500.030.06250.0625 ATCC435980.250.500.500.030.1250.0625HB6(RT012) 2010101500050.250.500.500.030.1250.03 2010102300060.1250.500.500.030.030.25 2011101800290.250.500.500.030.030.125 ATCC13820.250.500.500.030.0150.015HB3 2011041100150.250.500.500.030.06250.0625 2017030810500.250.250.500.030.030.0075 2012092001980.500.500.500.030.030.25HB24 2014050105940.250.06250.500.030.06250.25HB25 2012092001990.250.500.500.030.1250.125 2012092202050.500.501.000.030.030.0625 2012101502190.250.500.500.030.1250.125RT027 ATCC18700.502.002.000.030.06250.015RT038 ATCC7000570.501.000.500.030.030.015

另外，本研究結(jié)果還顯示20株艱難梭菌對非達霉素的MIC范圍在0.015～0.50 μg/mL，誘導(dǎo)后各菌株MIC范圍在0.0075～0.50 μg/mL之間，MIC范圍與國外報道一致，且多數(shù)菌株對非達霉素的MIC明顯低于萬古霉素。2014年Eitel等[17]研究顯示188株艱難梭菌對非達霉素的MIC范圍是介于0.008～0.5 μg/mL；2009年Citron等[18]測定了38株艱難梭菌對非達霉素的MIC值，結(jié)果顯示027型艱難梭菌MIC值在0.03～0.25 μg/mL之間，非027型艱難梭菌MIC值在0.008～0.25 μg/mL之間；2014年Rashid等[19]研究了32種不同核糖體分型共114株艱難梭菌對非達霉素的MIC，結(jié)果顯示各菌株對非達霉素的MIC在0.008～0.125 μg/mL之間，并且各型別菌株對非達霉素的敏感性無統(tǒng)計學(xué)差異。以上結(jié)果提示非達霉素對艱難梭菌抗菌活性較強，且與萬古霉素相比，非達霉素對艱難梭菌的敏感性更強。此外，非達霉素誘導(dǎo)前后20株艱難梭菌中13株菌的MIC值相對不變，3株菌的MIC值出現(xiàn)8倍增長，4株菌的MIC值出現(xiàn)4倍增長，但總體上，艱難梭菌對非達霉素仍十分敏感，提示非達霉素對艱難梭菌的體外抗菌活性的穩(wěn)定性良好，可能因為非達霉素是近些年剛剛上市的新型藥物， 2011年獲美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)上市，用于治療CDI的時間尚短；也可能與非達霉素的抗菌機制有關(guān)，非達霉素是一種大環(huán)內(nèi)酯類的窄譜抗生素，對革蘭陽性厭氧菌，尤其是對艱難梭菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌有很好的抗菌效果。非達霉素的作用機制主要是通過抑制細菌RNA聚合酶從而阻止轉(zhuǎn)錄過程。非達霉素先與DNA-RNA聚合酶復(fù)合物結(jié)合后，抑制σ亞基及DNA的解鏈，在沒有轉(zhuǎn)錄生成信使RNA時即阻止細菌的轉(zhuǎn)錄[20]。

目前，關(guān)于非達霉素對艱難梭菌敏感性的文獻報道相對較少。2011年Seddon等[21]報道了2株MIC值增高4～8倍的艱難梭菌，基因測序后發(fā)現(xiàn)β亞基上三種氨基酸突變(G1074K、V1143F、V1143D)，以及β′亞基上D237Y突變。2012年Seddon等[22]又在體外誘導(dǎo)出兩株MIC提高64倍的艱難梭菌，測序后發(fā)現(xiàn)β亞基上V1143G、V1143D、Q1074K、Q1074H和V1143G突變，β′亞基上R89G、I10R和R89G突變。2014年Babakhani等[23]也在體外誘導(dǎo)出1株16倍MIC值的艱難梭菌，測序發(fā)現(xiàn)β亞基上Q1074K和Q1143F，β′亞基上D237Y改變。但是上述文獻并沒有對各個突變與耐藥之間的關(guān)系進行后續(xù)報道，此外，由于誘導(dǎo)方法的差異、缺少重復(fù)性驗證等因素使結(jié)果出現(xiàn)不一致，需進一步的研究證實以上研究結(jié)果是否具有生物學(xué)意義。

萬古霉素不易被腸道吸收，因此，腸道內(nèi)藥物濃度高、作用持久、全身毒性小；非達霉素安全、腸道吸收少、對正常菌群影響小、結(jié)腸內(nèi)藥物分布濃度高。強翠欣等[24]曾通過構(gòu)建黃金地鼠艱難梭菌相關(guān)性腹瀉的動物模型發(fā)現(xiàn)非達霉素對高產(chǎn)毒艱難梭菌有較好的體內(nèi)抗菌作用，并且與萬古霉素相比，治療復(fù)發(fā)率低。萬古霉素和非達霉素在治療CDI過程中效果較好，因此，臨床醫(yī)生對這些藥物較為重視。本次的研究結(jié)果顯示，萬古霉素和非達霉素對艱難梭菌體外抗菌活性的穩(wěn)定性均較好，且艱難梭菌在體外不斷地接受這兩種抗菌藥物的壓力，也不易產(chǎn)生繼發(fā)耐藥，所以臨床上可放心使用萬古霉素和非達霉素治療CDI。

本研究在國內(nèi)首次采用體外多步誘導(dǎo)法檢測萬古霉素和非達霉素對艱難梭菌體外抗菌活性的穩(wěn)定性。萬古霉素是治療CDI的首選藥物，非達霉素是治療CDI的新興藥物，了解兩種藥物對艱難梭菌抗菌活性的穩(wěn)定性可為指導(dǎo)臨床用藥提供參考依據(jù)。但是，本研究也存在一些局限性，如菌株數(shù)量較少，且菌株主要來自河北地區(qū)，有地域局限性。將來我們還會繼續(xù)密切觀察，擴大病例數(shù)來追蹤萬古霉素和非達霉素在臨床應(yīng)用中的療效，及時發(fā)現(xiàn)并預(yù)防耐藥情況的發(fā)生。

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