宮頸癌宮頸脫落細胞中miR-21的表達及其診斷價值的探討

支亞麗，張詩蒙，栗俊杰，譚志容，李樹隆，莊 嚴

(深圳市蛇口人民醫院，廣東 深圳518067)

微小RNA(microRNA,miRNA)是在真核生物中發現的、內源性的、具有調控功能的大小約20-25個堿基的非編碼RNA[1]。近幾年的研究發現，miRNA能夠穩定存在于血液、尿液、唾液、乳汁、眼淚、分泌物等多種體液中[2]。一些miRNA對某些腫瘤具有特異性，因此，miRNA是一種良好的生物標志物，對腫瘤的診斷、評價療效、預后等有很好的指導意義。宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一，是由宮頸不典型增生逐步發展到原位癌，再進一步惡化為宮頸癌。因此宮頸癌的早期診斷對治療與預后十分重要。研究表明，miR-21在乳腺癌、結腸癌等多種腫瘤患者的血清中表達明顯升高[3]，這其中也包括宮頸癌。本研究通過SYBR Green熒光定量PCR法檢測宮頸粘液脫落細胞標本中的mi-21的表達情況，發現正常組與宮頸上皮內瘤變組、宮頸癌組中miR-21的表達水平存在明顯差異。

1 資料與方法

1.1 標本采集

深圳市蛇口人民醫院收治的門診、住院病人以及健康體檢者宮頸脫落細胞標本共90例，其中宮頸癌30例，年齡32-58歲；宮頸上皮內瘤樣病變30例，年齡31-59歲；正常組30例，年齡30-59歲。

1.2 儀器與試劑

All-in-OneTMmiRNA第一鏈cDNA合成試劑盒與All-in-OneTMmiRNA qPCR檢測試劑盒、miR-21引物以及內參U6引物購于中國廣州復能基因公司， TRIzol購于TAKARA。低溫離心機為Eppendorf 5230R，熒光定量PCR儀為羅氏Z480。

1.3 方法

1.3.1總RNA提取

取500 μl宮頸粘液上皮細胞標本于EP管中，加入500 μl TRIzol(TAKARA，日本)裂解細胞，為使細胞完全裂解，需要用移液槍反復吹打裂解液，吹打完成后，將EP管靜置5 min；在 EP管中加入0.1 ml的氯仿，為使有機相與水相充分反應，蓋緊離心管蓋，用手劇烈振蕩15 s，待溶液充分乳化(無分相現象)后，再室溫靜置10 min；低溫離心機(Eppendorf 5230R)程序設置溫度為4℃，12,000 g離心15 min。離心結束后，從離心機中慢慢取出EP管，不要搖晃EP管，這個時候可看到EP管中的液體分為3層，上層是上清液，無色透明，RNA即存在于此層。中間可見一小層白色的乳狀物，即蛋白，下層為紅色的有機層，RNA存在于上清液中。盡量多地吸取上清液到另一新的RNase free離心管中。沉淀RNA：加入與吸的上清液大致等體積的異丙醇，輕柔地來回顛倒，使其充分混勻，室溫靜置10 min；低溫離心機4℃下，12,000 g離心10 min，收集RNA沉淀，去上清；用無水乙醇與DEPC水配置75%乙醇，加入0.5 ml-1 ml 75%乙醇洗滌，低溫離心機4℃下，12,000 g離心5 min，去上清，將EP管超凈臺風干，待白色沉淀逐漸變透明后加入15-50 μl DEPC水溶解。

1.3.2逆轉錄

采用Trizol法提取總RNA后，測提取的RNA濃度，以總RNA為2 μg算出加RNA模板的體積。按照試劑說明書添加體系，進行逆轉錄(復能基因，廣州)，將RNA逆轉錄成cDNA。 miRNA逆轉錄體系為：5 μl 的5×PAP/RT Buffer；1 μl 的2.5 U/μl Poly A Polymerase；2 μg的RTase Mix 1 μl Total RNA；補RNase Free dH2O配成25 μl。PCR儀反應條件設定為：37℃，60 min；85℃，5 min。逆轉錄產物加入100 μl dH2O稀釋5倍后用于miRNA熒光定量檢測。

1.3.3miRNA熒光定量PCR

按照試劑說明書(復能基因，廣州)，配置熒光定量PCR反應液。反應體系為10 μl的2×All-in-OneTM； 2 μl 的qPCR Mix Universal Adaptor PCR Primer；2 μl 的All-in-OneTMmiRNA qPCR Primer，2 μl 的First-strand cDNA(diluted 1∶5)，dH2O 4.0 μl。反應條件為95℃，10 min；95℃，10 s；60℃，20 s；72℃，30 s，共40個循環。PCR儀為羅氏Z480。以U6作為內參microRNA，通過2-△△Ct來評價目標mRNA的表達水平，△△Ct=(標本Ct目的-標本內參)-(對照Ct目的-對照內參)。

1.4 統計學處理

本研究的數據采用SPSS17.0軟件中的Mann-Whitney U 檢驗進行組間比較，P<0.05為差異有統計學意義。ROC曲線采用Graphpad制作分析。

2 結果

2.1 各組宮頸粘液上皮細胞中miR-21的表達情況

用SYBR Green熒光定量PCR法檢測各組宮頸粘液脫落細胞標本中的mi-21的表達情況。由于各組均不滿足參數檢驗的條件，故使用非參數檢驗進行組間比較。由圖1所示，miR-21在正常組、宮頸上皮內瘤變組、宮頸癌組中相對表達中位數分別2.8733、13.3643、14.2617。miR-21在宮頸上皮內瘤變組明顯高于正常組，其差異均具有統計學意義(Z=-5.027，P<0.001)；宮頸癌組miR-21的表達相對正常組也明顯升高(Z=-5.648，P<0.001)。而miR-21的表達在宮頸上皮內瘤變組與宮頸癌組之間的差異不具有統計學意義(Z=-1.198，P=0.231)。

圖1 miR-21在正常組(Normal)、宮頸上皮內瘤變組(CIN)、宮頸癌組(CANCER)的表達水平

2.2 miR-21的ROC曲線分析

如表1所示，miR-21區別正常組與宮頸上皮內瘤樣病變組的ROC曲線面積為0.87(95%CI:0.793 5-0.962 1；P<0.001)，當臨界值為7.060時，敏感度為80%，特異度為80%，約登指數為60%。

表1 miR-21對宮頸上皮瘤變、宮頸癌的診斷價值ROC分析結果

如表1所示，miR-21區別正常組與宮頸癌組的ROC曲線面積為0.92(95%CI:0.859 0-0.989 9；P<0.001)，當臨界值為7.508時，敏感度為93.33%，特異度為80%，約登指數為73.33%。

3 討論

微小RNA(microRNA,miRNA)是內源性的、具有調控功能的非編碼RNA，由約20-25個堿基組成。miRNA能通過與靶 mRNA 的特異性堿基配對引起靶 mRNA 的降解、抑制或活化,對基因進行轉錄或轉錄后調控[1]。miRNA可通過調控細胞的癌基因和抑癌基因，參與腫瘤發生、發展、轉移、侵襲和預后等形成過程。大量的實驗研究表明大多數人類腫瘤中都存在miRNA的異常表達，而miRNA又可穩定地存在于人類各種體液中，因此可作為腫瘤標志物用于腫瘤的診斷與監測。

miR-21位于人類染色體脆性位點FRA17B上，該位點與腫瘤密切相關[4]。因此，miR-21在大多數惡性腫瘤中表達增高。在宮頸癌細胞株HeLa細胞中，miR-21可抑制其靶基因PDCD4的表達，促進細胞增殖[5]；miR-21也可通過抑制TIMP3的表達，促進HeLa細胞生長，抑制其凋亡[6]。Yao等發現，miR-21在宮頸癌組織中表達增高，并且miR-21可通過調控CCL20基因，促進宮頸癌的發生與發展[7]。miR-21還可抑制PTEN表達，促進宮頸癌細胞增殖[8]。血清中的循環miR-21與宮頸癌淋巴結轉移有關[9]。

由于miRNA被證明能穩定存在于血清、尿液等各種體液中，因此近些年來miRNA作為疾病新型生物標志物用于診斷疾病成為了研究熱點。研究表明，miR-21在宮頸癌組織的表達高于正常宮頸組織。在宮頸癌患者的血清中的miR-21的表達量明顯高于非宮頸癌患者。然而，血清或血漿中的miR-21可在多種惡性腫瘤中異常表達：如乳腺癌、結腸癌、肝細胞癌、肺癌等等，除此之外，miR-21還可在非腫瘤疾病患者的血清中表達異常：如肝炎、糖尿病等。因此血清中的miR-21的異常表達并不能針對性地反映某種疾病，不具備某種疾病的特異性[3]。

本研究通過實時熒光定量PCR檢測宮頸癌脫落細胞中miR-21的表達水平，發現宮頸粘液脫落細胞標本中的miR-21在宮頸癌與癌前病變患者表達升高(P<0.001)。ROC曲線分析結果顯示，miR-21可區分正常組和宮頸上皮內瘤樣病變組，其ROC曲線面積為0.87，說明診斷價值中等，其敏感度為80%，特異度為80%。miR-21在正常組和宮頸癌組的ROC曲線面積為0.92，說明診斷價值較高，其敏感度為93.33%，特異度為80%。

綜上所述，宮頸粘液脫落細胞中的miR-21對宮頸癌及其癌前病變具有診斷價值。而宮頸粘液脫落細胞標本有著無創、易于取樣、易于檢測等特點，而且相對于血清標本，對宮頸癌更具有特異性。因此，宮頸粘液脫落細胞中的miR-21可以作為宮頸癌篩查與診斷以及預后判斷的生物標志物，但是尚需進一步的大樣本臨床驗證。

參考文獻：

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[5]Yao Q,Xu H,Zhang QQ,et al.MicroRNA-21 promotes cell proliferation and down-regulates the expression of programmed cell death 4 (PDCD4) in HeLa cervical carcinoma cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2009,388(3):539.

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[7]Yao T,Lin Z.MiR-21 is involved in cervical squamous cell tumorigenesis and regulates CCL20[J].Biochim Biophys Acta,2012,1822(2):248.

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[10]陳文璟，溫旺榮.SYBR Green I熒光定量PCR檢測宮頸癌血清中miR-21的表達[J].臨床檢驗雜志，2011，29(7)：523.