植物乳桿菌活菌計數方法的優化

□ 王雅麗 張曉蕊 范翠翠 徐長隆 漢臣氏（沈陽）兒童制品有限公司

乳酸菌是一類能發酵碳水化合物產生大量乳酸的細菌的總稱，其大量存在于胃腸道中，是人體腸道內的益生菌群，其可以代謝產生有機酸、細菌素、過氧化氫和雙乙酰等多種天然抑菌物質，對人體健康有很大的促進作用。大部分乳酸菌產品中的乳酸菌數量基數非常高，可達到1010CFU/g。乳酸菌產品由于其特異性、多樣性，敏感性導致其易受環境影響，因此檢測過程中的細微差別都可能影響活菌計數的穩定性和準確性。本實驗從培養基配方的篩選、培養時間及培養方式三個方面設計，優化出一種節約成本、縮短試驗周期的檢驗方法，可廣泛用于實驗室研發及車間生產；同時，加強乳酸菌相關產品的檢測，對于提高產品質量，保護消費者的利益及健康，都有重要的意義[1-2]。

1 材料和設備

1.1 菌種

植物乳桿菌HCS03-007：漢臣氏（沈陽）兒童制品有限公司分離，實驗室保存。

1.2 培養基

1.2.1 合成MRS

合成MRS購于北京奧博星生物技術有限公司。

1.2.2 自配MRS

蛋白胨1 0 g，牛肉粉5g，酵母粉4g，磷酸氫二鉀2g，檸檬酸三胺2g，醋酸鈉5g，葡萄糖20g，吐溫-80 1mL，硫酸鎂0.2g，硫酸錳0.05g，調節pH值6.2，瓊脂15g，蒸餾水1000mL，121℃高壓滅菌20 min。

1.2.3 番茄汁MRS

在自配MRS中添加1%的番茄汁（番茄汁制備方法：新鮮的番茄洗凈，稱取100g于榨汁機內粉碎充分，煮沸5min，三層紗布過濾后，用水補至200mL）。

1.2.4 pH6.0/6.4MRS

自配MRS調節pH值6.0/6.4。

1.3 實驗器皿

300mL錐形瓶、移液槍、10mL離心管、玻璃平皿等。

1.4 儀器與設備

電子天平、pH計、蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺、培養箱、厭氧培養袋、產氣包等。

2 實驗方法

2.1 實驗設計

本試驗通過單因素實驗，分別考察培養基配方、培養時間、需氧型等方面對HCS03-007植物乳桿菌進行計數，挑選合適條件對以后實驗進行優化。

2.2 操作步驟

2.2.1 菌種活化

將公司實驗室-80℃保存的凍存管HCS03-007進行活化，以10%的接種量接種，傳代三次，得到的菌種冰箱保存備用。

2.2.2 系列稀釋及計數培養

將上述活化后的第三代菌液用0.85%的無菌生理鹽水進行梯度稀釋，根據對樣品濃度的估計，選擇10-6、10-7的樣液加入相應的培養基，進行需氧和厭氧培養，48h計數一次，記錄結果，繼續培養至72h，計數并記錄結果。

3 結果與分析

實驗數據詳見表1。

根據表1可知，HCS03-007植物乳桿菌培養48h與72 h，實驗結果完全沒有變化，故確定計數實驗采取48h培養；HCS03-007植物乳桿菌在需氧、厭氧條件下計數結果差異不顯著，說明植物乳桿菌在培養過程中，對氧氣的敏感度低，故確定計數實驗采取需氧培養；HCS03-007植物乳桿菌在合成培養基中計數結果最佳，其次為番茄汁MRS，且合成培養基中的結果僅為番茄汁MRS的1.05倍，差異不顯著，考慮到成本因素，故確定計數實驗培養基為番茄汁MRS。

表1 植物乳桿菌HCS03-007菌落計數結果

4 結論

本實驗確定了適用于植物乳桿菌計數的培養基為添加1%番茄汁、pH值為6.2的自配MRS培養基，需氧培養48 h進行計數。本實驗初步對植物乳桿菌計數方法進行了優化，后續還可開展試驗操作角度的優化，如培養基灌注方式，點樣或涂布計數等，以期在處理大量樣品時，找到一種有效、簡單、快速和相對經濟的活菌計數方法。