IgG 、Gab2、PTEN 在人腦膠質瘤中的表達及其臨床意義

張緒美 張燕 陳敏

濰坊醫學院附屬醫院病理科（山東濰坊261031）

膠質細胞瘤（glioma）是中樞神經系統最常見的腫瘤，其發病率約占所有顱內腫瘤的45%左右，膠質瘤的浸潤復發是導致患者死亡的主要原因。研究膠質瘤侵襲轉移機制，尋找有效的治療靶點是膠質瘤治療中需要解決的問題。最近的研究發現，多種上皮來源的腫瘤細胞能夠合成免疫球蛋白G（IgG），并影響腫瘤細胞的分化、增殖、侵襲［1-2］，這逐漸成為腫瘤免疫研究的新熱點，并且近年來一項前列腺癌的研究中發現IgG是前列腺癌治療的潛在靶點［3］。但是IgG在膠質瘤中的表達、分布及其對膠質瘤浸潤、復發的影響罕見有報道。Gabs家族蛋白［Grb2-associated binder（Gab）family proteins］是一類支架蛋白，Gabs蛋白包括Gab1～4多個家族成員，其中Gab2調控細胞生長增殖、分化、凋亡、侵襲等生命過程，具有潛在的原癌基因特性。PTEN是迄今為止發現的第一個具有磷酸酶活性的抑癌基因，在許多不同類型的腫瘤組織中存在著PTEN基因不同程度的突變或丟失。本研究應用原位雜交、免疫組化方法探測人腦膠質瘤中mRNA及IgG蛋白的表達，并分析其與Gab2、PTEN蛋白表達的關系，探測其對膠質瘤生物學行為的影響，為膠質瘤的治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 標本來源 選取濰坊醫學院附屬醫院、濰坊市人民醫院2011年1月至2013年12月手術切除并經病理證實的膠質瘤標本55例。男30例，女25例，年齡11～74歲，中位年齡44歲。按WHO中樞神經系統膠質瘤分類標準進行分級，并將Ⅰ～Ⅱ級歸為低級別組，Ⅲ～Ⅳ級為高級別組，低級別組25例，高級別組30例。所有標本均用100 mL/L的甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，厚4 μm。另取20例正常腦組織（腦外傷內減壓獲得）作為對照。

1.2 試劑 IgG多克隆抗體購自SIGMA公司。原位雜交探針及相關試劑由濰坊醫學院牛娜博士提供。Gab2多克隆抗體購自Santa Cruz公司。PTEN單克隆抗體、SP試劑盒、DAB試劑盒、AEC試劑盒均購自福州邁新生物公司，操作步驟按說明書進行。PBS液代替一抗作陰性對照。

1.3 檢測方法 免疫組化SP二步法檢測IgG、Gab2、PTEN蛋白表達，石蠟標本5 μm切片，常規脫蠟入水，熱抗原修復，SP法免疫組化染色，Gab2、PTEN兩種抗體DAB鏡下控制顯色，IgG抗體AEC鏡下控制顯色。PBS液代替一抗作免疫組化陰性對照，IgG正義探針作為原位雜交陰性對照。

1.4 結果判定 顯微鏡下隨機觀察10個高倍視野，每個視野計數100個細胞。IgG蛋白以腫瘤細胞胞漿內出現紅色顆粒為陽性。Gab2陽性染色為棕黃色顆粒，分布于膠質瘤細胞膜和細胞漿。PTEN陽性表達位于細胞胞質，胞核部位出現著色視為陰性。IgG mRNA陽性信號為藍紫色，呈細顆粒狀，分布于腫瘤細胞胞漿。

免疫組化結果判定：觀察染色強度、部位、并計算陽性細胞數：靶細胞陽性率＜5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，＞50%為3分；著色強度按切片中細胞顯色有無及染色深淺記分，細胞無顯色為0分，淺棕黃色（淡紅色）為1分，棕黃色（紅色）為2分，棕褐色（深紅色）為3分。將兩計分相加，0～1分蛋白表達陰性，≥2分為蛋白表達陽性。原位雜交結果判定：只要腫瘤細胞胞漿內見到紫藍色顆粒，即為IgG mRNA陽性。

1.5 統計學方法 采用SAS 9.1統計軟件進行統計分析，IgG、Gab2及PTEN在各級別膠質瘤中的表達率比較采用χ2檢驗，IgG、Gab2及PTEN表達相關性分析采用Spearman等級相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IgG、Gab2、PTEN在膠質瘤中的表達 膠質瘤組織中有IgG蛋白及IgG mRNA表達（圖1、2）。IgG在膠質瘤組織中表達陽性率為69.0%（38/55），在正常腦組織中表達率為5.0%（1/20），差異具有統計學意義（χ2＝24.136 8，P＜ 0.05）；膠質瘤組織中Gab2陽性率為52.7%（29/55），在正常腦組織中表達率為5.0%（1/20），差異具有統計學意義（χ2＝13.920 5，P＜0.05）；PTEN在膠質瘤中表達率為25.5%（14/55），在正常腦組織中表達陽性率為85.0%（17/20），差異具有統計學意義（χ2＝21.445 5，P＜ 0.05）。見圖3、4、表1。

圖1 IgG蛋白Ⅲ級在膠質瘤中的表達，細胞漿可見紅色顆粒（×400） 圖2 高級別膠質瘤細胞漿中IgG mRNA的陽性信號（ISH×200）glioma gradeⅢ 圖3 Gab2蛋白在Ⅲ級膠質瘤表達，細胞漿可見棕黃色顆粒（+++）（×400） 圖4 PTEN蛋白在正常腦組織表達，細胞漿可見棕黃色顆粒（+++）（×400）Fig.1 Positive IgG protein in glioma gradeⅢ Fig.2 Positive IgG mRNA in glioma gradeⅢ Fig.3 Positive Gab protein in glioma grade Ⅲ Fig.4 Positive PTEN protein in normal brain（+++）（× 400）

IgG在低級別膠質瘤中的表達率為44.0%（11/25），在高級別膠質瘤中表達率為90.0%（27/30），差異具有統計學意義（χ2＝13.511 6，P＜ 0.05）。Gab2在低級別膠質瘤中的表達率為36.0%（9/25），在高級別膠質瘤中的表達率為66.7%（20/30），差異具有統計學意義（χ2＝5.145 0，P＜ 0.05）。PTEN在低級別膠質瘤中的表達率為32.0%（8/25），在高級別膠質瘤中的表達率為20.0%（6/30），差異無統計學意義（χ2＝1.0348，P＞0.05）。見表2。

2.2 膠質瘤中IgG表達與Gab2、PTEN表達的相關性 膠質瘤中IgG表達與Gab2、PTEN表達的相關性，見表3。膠質瘤中IgG與Gab2表達呈正相關（r＝ 0.312 4，P＜0.05），與PTEN 表達呈負相關（r＝-0.422 0，P＜ 0.05）。

表1 正常腦組織與腦膠質瘤中IgG、Gab2、PTEN蛋白陽性率比較Tab.1 Expressions of IgG,Gab2 and PTEN in glioma and normal brain tissue 例（%）

表2 低級別與高級別膠質瘤中IgG、Gab2、PTEN陽性率比較Tab.2 Expressions of IgG，Gab2and PTEN in high grade glioma and low grade glioma 例（%）

表3 膠質瘤中IgG表達與Gab2、PTEN表達的相關性分析Tab.3 The relationship of IgG protein expression with Gab2 and PTEN in glioma 例

3 討論

膠質瘤系浸潤性生長物，手術難以切除或根本不能手術，其浸潤和復發是導致患者死亡的主要原因。近年來，隨著研究的深入，免疫靶向治療成為膠質瘤臨床研究的重點，對腫瘤免疫分子的研究也是腫瘤研究的熱點。

經典的免疫學理論認為，免疫球蛋白是B淋巴細胞產生的，其他的體細胞不會表達免疫球蛋白。但近年來研究發現［4］，該蛋白以及mRNA存在于免疫細胞之外的其他細胞中，特別是一些增生的上皮細胞和癌細胞中，如乳腺癌、結腸癌、肝癌、肺癌等，其類似生長因子，具有促進腫瘤細胞增殖、抑制凋亡的作用。CHEN等［1］同樣證實了上皮來源的癌細胞分泌的IgG能夠促進腫瘤細胞的生長和生存。在結直腸癌組織中，IgG的表達和腫瘤的惡性程度，包括分化、Dukes分期具有顯著相關性，即結直腸癌分化程度越差，Dukes分期越高，表達IgG越多［5］。通過小干擾RNA技術抑制前列腺癌細胞中IgG表達后，癌細胞的增殖標志物降低［3］。本研究觀察到，IgG在正常腦組織中低表達，隨著膠質瘤惡性程度的增加，表達水平逐漸升高，這與文獻［6］報道一致，表明IgG可能促進膠質瘤的發生、增殖。綜合上述研究筆者推測腫瘤細胞產生的IgG有可能成為抗膠質瘤治療的新靶點，為腫瘤的預后判斷及治療提供新的思路。

多項研究表明，Gab2是腫瘤相關蛋白，具有潛在的原癌基因特性，它的異常活化和表達促進腫瘤的發生、轉移［7-8］。MATSUMURA等［9］發現，Gab2在結腸癌組織中高表達，Gab2表達高的患者生存期明顯低于低表達者。通過干擾技術抑制或者降低Gab2的表達后，膠質瘤細胞的侵襲轉移能力降低［10-11］。本研究觀察到，Gab2蛋白在不同病理級別的膠質細胞瘤中的表達隨著臨床病理級別的增高有增高的趨勢，進一步說明Gab2的表達與腦膠質瘤惡性進展有關。Gab2可以作為預測膠質瘤預后的一個指標，有望成為膠質瘤治療的新靶點。

有研究證實，Gab2活化后與磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）的P85亞基結合，通過參與PI3K/Akt/ARK5信號通路促進乳腺癌的侵襲與轉移［12］，而抑癌基因PTEN也是與PI3K的P85亞基結合，正調節PI3K/PTEN信號通路的活性［13］，并且PI3K/PTEN信號通路與腫瘤血管的形成及腫瘤的增殖轉移相關［14-15］。本研究還檢測到膠質瘤中IgG與Gab2高表達，二者表達呈正相關，PTEN低表達，與IgG表達呈負相關，提示三者相互作用，是否在膠質瘤中IgG也參與了PI3K信號通路，是否通過正調節PI3K信號通路就能抑制膠質瘤細胞的增殖、侵襲，這有待于下一步的研究證實。

綜上所述，IgG在膠質瘤腫瘤細胞中的異常表達具有重要的功能和病理學意義，IgG和腦膠質瘤的惡性轉化具有相關性。對這一現象的深入研究，將可能揭示免疫球蛋白新的生理和病理功能，對腫瘤的診斷、預后判斷以及靶向治療提供新的思路。

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