腦膠質瘤分子標志物IDH1、IDH2、p53基因突變和Ki-67蛋白表達與病理分級臨床特征的關系

孫怡 李惠 吳頤 李健 申龍樹 王耀輝 王劍蓉 章宜芬

南京中醫藥大學附屬江蘇省中醫院1病理科/國家中醫藥管理局分子生物學三級實驗室，2神經外科（南京 210029）

膠質瘤是最常見的顱內惡性腫瘤，其發病率約占原發性腦腫瘤的40%～50%左右，而且呈逐年上升趨勢［1-2］。近年來，分子標記物檢測作為補充診斷依據、預測預后疾病的手段，極大推進了原有的單純組織學分類。異檸檬酸脫氫酶1（isocitrate dehydrogenase 1，IDH1）、異檸檬酸脫氫酶 2（isocitrate dehydrogenase 2，IDH2）基因是膠質瘤研究的熱點，已有大量研究表明，該基因突變是膠質瘤的一個獨特類型。國外研究報道IDH1突變好發于年輕膠質瘤患者，早于p53基因突變的發生，是膠質瘤發生發展中的早期分子事件，IDH1突變的患者預后相對較好；國內研究報道IDH在少突膠質細胞腫瘤和混合性膠質瘤中突變較高，這均表明IDH基因可能成為新的治療靶點。傳統病理分型中的該基因型特征研究較少，本研究通過研究傳統病理分型中該基因的特征及分布規律，為膠質瘤分子病理學分類提供新的依據，也為臨床治療和新藥開發提供新的靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年1月至2016年12月我院手術切除、臨床資料完整腦膠質瘤樣本46例。其中男25例，女21例，年齡12～73歲，中位年齡50.0歲。根據2007年WHO中樞神經系統腫瘤分級標準進行組織學分類分級，兩位高年資病理醫師復診，共有Ⅰ級1例，Ⅱ級10例，Ⅲ級12例，Ⅳ級23例。以5例同期手術的腦膜瘤樣本作為陰性對照。

1.2 方法

1.2.1 IDH1、IDH2基因，p53基因突變檢測 根據HE染色切片確認膠質瘤腫瘤區域并刮取相應白片腫瘤組織，按操作手冊（Qiagen GeneRead DNA FFPE kit，德國）提取DNA。PCR擴增后凝膠電泳觀察產物是否為目的條帶，利用Bigdye Terminator（v3.1）進行測序反應，產物上ABI 3500型基因分析儀（ABI公司，美國）正反向測序，測序結果用Seqscape軟件與標準序列進行比對，檢測分析IDH1基因R132位點、IDH2基因R172位點以及p53基因第5～8外顯子突變狀態，具體引物序列如下：IDH1上游：5′-TGTGGAAATCACCAAATGGCAC-3′；IDH1 下 游 ：5′-ACATACAAGTTGGAAATTTCTGGGC-3′；IDH2 上游：5′-TCCCAATGGAACTATCCGGAAC-3′；IDH2 下 游 ：5′-GACAAGAGGATGGCTAGGCG-3′；p53-exon5-6上游：5′-TACTCCCCTGCCCTCAACAAGA-3′；p53-exon5-6下游：5′-CAAATAAGCAGCAGGAGAAAGC-3′；p53-exon7上游：5′-TTGCCACAGGTCTCCCCAAG-3′；p53-exon7 下游：5′-GTCCCAAAGCCAGAGAAAAG-3′；p53-exon8上游：5′-AGGACAAGGGTGGTTGGGAG-3′；p53-exon8 下 游 ：5′-TGGGCAGTGCTAGGAAAGAG-3′。

1.2.2 Ki-67蛋白表達檢測 鼠抗人Ki-67蛋白一抗、試劑盒及顯色液購自福州邁新生物技術開發有限公司，免疫組化染色采用SP法。樣本常規福爾馬林固定、石蠟包埋，切3 μm薄片，脫蠟水化，在微波爐中用檸檬酸鈉抗原修復液中100℃抗原修復15 min，PBS沖洗后用雙氧水阻斷15 min，沖洗后用羊血清室溫下阻斷40 min，加入一抗，4℃冰箱過夜，PBS沖洗后，加入二抗，37℃，40 min，PBS沖洗后，DAB顯色。結果判讀：由我院病理科醫師對免疫組織化學染色進行評價，參照《邁新免疫和分子病理學產品目錄》抗體表達特定，以細胞核中出現淺黃色至棕褐色信號為陽性細胞，選取腫瘤細胞豐富、陽性細胞較多的熱點區域，計數5個高倍鏡視野，計算視野內腫瘤細胞中陽性細胞平均占比（%），參考文獻［3］報道以≤30%判為低表達，＞30%判為高表達。

1.3 統計學方法 所有計數資料表示為多個樣本率（構成比），應用SPSS 24.0軟件，采用χ2或Fisher精確概率法檢驗IDH1突變與臨床特征（性別、年齡、腫瘤位置、腫瘤最大徑、WHO分級等）以及分子標志物Ki-67表達的差異性分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 膠質瘤樣本WHO分類分級 包括胚胎發育不良性神經上皮腫瘤（WHOⅠ級）1例，星形細胞瘤（WHOⅡ級）5例，少突膠質細胞瘤（WHOⅡ級）4例，少突星形細胞瘤（WHOⅡ級）1例，間變型星形細胞瘤（WHOⅢ級）7例，間變型少突膠質細胞瘤（WHOⅢ級）3例，間變型少突星形細胞瘤（WHOⅢ級）2例，膠質母細胞瘤（WHOⅣ級）23例（其中3例為繼發）。發生部位：額葉19例，其他部位27例。見圖1。

2.2 IDH1、IDH2突變檢測結果 檢測發現32.6%（15/46）的樣本發生IDH1基因突變，均位于第132位密碼子（c.G395A，p.R132H），見圖2，未發現IDH1基因其他突變類型和IDH2基因突變。IDH1基因突變與各項臨床病理特征間的關系見表1。統計顯示，較低年齡（P＝0.028）、腫瘤位置發生于額葉（P＝0.002）、WHOⅡ-Ⅳ級組織學分級（P＝0.047）、Ki-67蛋白低表達（r＝-0.313，P＝0.034）均與IDH1基因突變顯著相關。而患者性別、腫瘤最大徑與IDH1基因是否突變無顯著性相關。突變型樣本中男10例，女5例，年齡12～62歲，中位年齡47.0歲；31例野生型樣本中男15例，女16例，年齡14～73歲，中位年齡53.0歲。不同WHO級別膠質瘤之間IDH1基因突變陽性率分別為：Ⅱ級 60%（6/10），Ⅲ級 41.7%（5/12），Ⅳ級17.4%（4/23，其中3例為繼發），突變率從低級別膠質瘤到高級別膠質瘤呈下降趨勢，差異有統計學意義（P＜0.05）。73.3%（11/15）突變位于額葉。

2.3 p53基因突變檢測結果 檢測第5、6、7、8外顯子突變情況，發現4例標本發生突變，突變位點主要位于第7、8外顯子，均診斷為膠質母細胞瘤（WHOⅣ級，25%），并伴IDH1野生型。見圖3。

2.4 Ki-67陽性表達情況 Ki-67陽性染色定位于細胞核，呈棕黃色顆粒狀。在46例膠質瘤組織中，均有發現腫瘤細胞陽性表達，其中低表達65.2%（30/46），高表達34.8%（16/46）。不同級別膠質瘤中Ki-67表達見表2，WHOⅡ～Ⅳ級膠質瘤表達明顯升高，Ki-67表達與WHO分級成顯著線性正相關（r＝0.700，P＜ 0.001）。

圖1 不同級別膠質瘤HE染色圖（×100）Fig.1 HE staining of different levels of gliomas（×100）

圖2 IDH1基因395位堿基G/A雜合突變Fig.2 Heterozygous 395G/A IDH1 mutation

表1 納入本研究患者臨床病理特征以及IDH1-R132H突變分布情況Tab.1 The relationship between IDH1-R132H mutation and clinical pathology

3 討論

神經膠質瘤在神經上皮性腫瘤中占60%，是顱內最常見的腫瘤。不同級別膠質瘤有不同發生機制，預后差別大。尋找相關的分子生物學標記有重要意義。2006年美國癌癥基因組圖譜計劃對206例膠質母細胞瘤行高通量基因組學分析，發現IDH1或IDH2突變腫瘤生存期更長［4-5］。2008年PARSONS等［6］發現 12%的樣本發生 IDH1基因R132H突變；另有研究［7］發現IDH2同工酶基因R172位點也是膠質瘤突變熱點。

圖3 p53基因突變圖Fig.3 Mutations in p53 gene

表2 Ki-67在WHOⅡ～Ⅳ級別膠質瘤中的表達Tab.2 Ki-67 expression in WHOⅡ～Ⅳgliomas 例（%）

IDHl基因突變只在膠質瘤的某些特定亞型中發生，其陽性突變患者年齡更低，主要發生在彌漫性星形細胞瘤、少膠質細胞瘤等（WHOⅡ級）和繼發性膠質母細胞瘤（WHOⅣ級）［7-8］，提示這幾種腫瘤可能具有相同的起源途徑，有助于膠質瘤的診斷分型和鑒別診斷。在各級別膠質瘤中，相對于IDH野生型，IDH基因突變的患者預后較好［9］，IDH突變狀態可以輔助診斷腦膠質瘤。本研究檢出32.6%的樣本發生IDH1-R132H突變，發生于WHOⅡ～Ⅲ級的膠質瘤，3例繼發性膠質母細胞瘤均發生突變，原發性膠質母細胞瘤無一檢出。較低年齡、腫瘤位置發生于額葉、WHOⅡ～Ⅳ級組織學分級、Ki-67蛋白低表達均與IDH1基因突變顯著相關。IDH1突變陽性率從低級別（WHOⅡ級）到高級別（WHOⅣ級）顯著下降，提示膠質瘤患者的預后與IDH1基因突變存在密切聯系。IDH1突變與膠質瘤病理分級、惡性程度及預后密切相關，在疾病發生初始階段檢測IDH1基因突變狀態，輔助病理醫師診斷分級，協助臨床醫師制定合理治療方案，從而提高膠質瘤治愈率。

WHO（2016）中樞神經系統腫瘤分類首次將分子檢測納入腦腫瘤診斷標準，所有組織學級別均應首先檢測IDH突變狀態，以及1p/19q、ATPX、p53等基因變異情況。p53基因是一種抑癌基因［10］，80%～90%的腫瘤p53基因突變發生在中間區域（95-288密碼子）［11］。原發性膠質母細胞瘤p53陽性率高于其他類型膠質瘤，并與IDH1突變無相關性。本研究發現4例樣本p53基因突變，突變位點位于第7、8外顯子，均為膠質母細胞瘤樣本伴IDH1野生型，或與腫瘤高度惡性相關，根據其分子分型（IDH1/2野生型，p53突變型）預后最差［9］。目前p53基因突變主要檢測方法是用突變型p53抗體免疫組化檢測，但p53免疫組化陽性與p53基因突變二者之間的關系尚存爭議［11］，不能完全用p53突變型免疫組化抗體陽性取代p53基因突變檢測。與國外報道相比［12］，本研究突變率偏低，或與中國人p53突變熱點差異性和入組樣本病理學分級有關。

Ki-67與細胞周期密切相關，能直接反映細胞增殖情況，與腫瘤進展、轉移密切相關。Ki-67在正常腦組織中不表達，在膠質瘤細胞中異常高表達，Ki-67陽性標記指數越高，則惡性程度（分級）越高，預后越差［13］。本研究結果顯示Ki-67蛋白表達水平隨膠質瘤病理分級的增高而顯著增高，高級別膠質瘤表達水平明顯高于低級別膠質瘤，Ki-67表達與WHO分級成顯著線性正相關，提示Ki-67過表達可能是膠質瘤形成過程中的晚期事件，隨腫瘤惡性程度升高而表達增高，反映較差預后。而本研究顯示Ki-67蛋白低表達與IDH1基因突變顯著相關，與文獻［14］報道相似，均可作為膠質瘤預后評估的指標［15］。

綜上，本研究通過檢測膠質瘤IDH1、IDH2基因、p53基因突變狀態，檢測Ki-67表達水平，發現在各種類型中，中高級別（WHOⅡ/Ⅲ級）膠質瘤IDH1基因突變比率最高，提示該類型有特殊性，臨床需要高度關注，應盡量對該類型進行基因檢測；p53基因突變主要發生于膠質母細胞瘤中。IDH1基因突變、Ki-67表達水平與膠質瘤額惡性程度密切相關，IDH1、p53、Ki-67聯合檢測有利于膠質瘤的診斷分級和預后評估，具有一定的臨床價值。IDH1基因突變與Ki-67表達在膠質瘤的發展中是否存在內在聯系以及相關臨床意義，尚需進一步研究。

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