凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達(dá)促進(jìn)癲癇發(fā)作

折瀟 王林 張世俊 張蓓 李亞軍

西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（西安710077）

癲癇是一組由腦部神經(jīng)元高度同步化異常放電所導(dǎo)致的慢性腦部疾病，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)病率僅次于腦血管病。流行病學(xué)研究顯示，癲癇的患病率為3.6‰ ～7.0‰，其中約25%為難治性癲病［1］。顳葉癲癇（temporal lobe epilepsy，TLE）是最常見的難治性癲癇，反復(fù)發(fā)作嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和生命安全，其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚［2］。

多個(gè)研究表明，免疫介導(dǎo)的血腦屏障的破壞可能參與了TLE的反復(fù)發(fā)作［3］。基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）激活后能降解血管基底膜，包括膠原、纖維連接蛋白和基膜，損傷血腦屏障增加通透性，可能導(dǎo)致慢性癲癇病灶形成［4］。但是，目前MMP-9參與TLE的機(jī)制過程并不清楚。已有研究顯示，在中樞血管內(nèi)皮細(xì)胞中，MMP-9的活性受凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）的調(diào)控［5］。本研究應(yīng)用鋰-匹羅卡品癲癇模型，觀察癲癇大鼠海馬ASK1和MMP-9表達(dá)變化，并探討其在TLE發(fā)生中的作用與機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組 健康雄性SD大鼠（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心）100只，8～10周齡，體質(zhì)量200～220 g，SPF級(jí)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，溫度20～25℃，相對(duì)濕度40%～70%，光暗周期為12 h/12 h，自由進(jìn)食常規(guī)飼料和清潔飲水，正常營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)。動(dòng)物隨機(jī)分為對(duì)照組、癲癇組、ASK1抑制劑組和MMP-9抑制劑組，其中癲癇組按造模時(shí)間點(diǎn)分為：1 d組、3 d組及7 d組，每組10只大鼠。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)本單位實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作規(guī)程執(zhí)行，符合本單位動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理道德規(guī)范。

1.2 動(dòng)物模型制備及處理 癲癇組大鼠經(jīng)腹腔注射氯化鋰（120 mg/kg，Sigma-Aldrich，美國），20 h后經(jīng)腹腔注射硫酸阿托品10 mg/kg，30 min后腹腔注射匹羅卡品30 mg/kg（Sigma-Aldrich）。當(dāng)大鼠癲癇發(fā)作按Racine評(píng)分達(dá)4級(jí)或以上時(shí)為造模成功，出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài)1 h以上或抽搐致瀕危時(shí)給予腹腔注射安定10 mg/kg，終止癲癇發(fā)作。對(duì)照組大鼠接受等體積生理鹽水注射，癲癇組進(jìn)行鋰-匹羅卡品造模，ASK1抑制劑組和MMP-9抑制劑組接受鋰-匹羅卡品造模3 d，同時(shí)分別接受10 mg/（kg·d）的ML365（MCE，美國）和5 mg/（kg·d）的GM6001（MCE）腹腔注射。

1.3 改良Racine評(píng)分 無癲癇發(fā)作為0分；有凝視癥狀發(fā)作為1分；濕狗樣抖動(dòng)和規(guī)律性點(diǎn)頭，不伴有或伴有面部抽動(dòng)為2分；單側(cè)前肢陣攣為3分；后肢站立，前肢抖動(dòng)，持續(xù)性點(diǎn)頭為4分；肢體顫動(dòng)，失平衡跌倒，全身強(qiáng)直陣攣為5分；發(fā)作衰竭死亡記為6分。

1.4 動(dòng)物取材 4%水合氯醛麻醉后打開胸腔，由心尖經(jīng)二尖瓣至主動(dòng)脈，0.9%氯化鈉快速灌注。然后4%多聚甲醛先快后慢灌注20 min。斷頭取腦，4%多聚甲醛固定24 h進(jìn)行石蠟包埋。另外的實(shí)驗(yàn)大鼠則給予4%水合氯醛麻醉后，斷頭直接取腦，并剝離海馬保存在液氮中，用于后期檢測(cè)。

1.5 Western blot檢測(cè) 凍存的海馬組織加入RIPA裂解液（碧云天，中國）研磨裂解，4℃離心，取上清。8%SDS-PAGE凝膠電泳，250 mA、80 min轉(zhuǎn)至PVDF膜。MMP-9一抗（1∶1 000，CST，美國）和ASK1一抗（1∶1 000，CST）4℃孵育過夜。辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠、羊抗兔二抗（1∶1 000，碧云天）37℃孵育1 h。化學(xué)發(fā)光后凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad，美國）中曝光檢測(cè)。

1.6 免疫熒光組織化學(xué)染色 海馬組織冰凍切片，厚度6 μm，室溫固定，蒸餾水沖洗，3%H2O2室溫孵育30 s，蒸餾水沖洗。羊血清室溫封閉1 h，滴加MMP-9抗體（1：100），4℃孵育過夜。PBS沖洗后，滴加熒光山羊抗兔二抗（1：1 000，Invitrogen，美國），37℃孵育1 h。PBS沖洗后，激光共聚焦顯微鏡下觀察結(jié)果。紅色標(biāo)記的為MMP-9免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多組樣本比較采用單因素方差分析，同時(shí)采用Newman-Keuls分析檢測(cè)兩兩差異。所有數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 5.0軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物行為學(xué)觀察 Racine評(píng)分結(jié)果顯示，對(duì)照組均未出現(xiàn)癲癇發(fā)作癥狀，而癲癇組大鼠在造模后1、3、7 d均出現(xiàn)不同程度的癲癇發(fā)作，發(fā)作次數(shù)和評(píng)分均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05，表1）。在癲癇組之間，造模后3 d癲癇發(fā)作程度達(dá)到高峰，發(fā)作次數(shù)和評(píng)分均相對(duì)較高，其發(fā)作次數(shù)顯著高于癲癇1 d組（P＜0.05，表1）。7 d組發(fā)作次數(shù)和Racine評(píng)分有輕微降低，但與3 d組差異無顯著性。

表1 各組大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)和Racine評(píng)分Tab.1 The epileptic seizure frequency and Racine score in different groups ±s

表1 各組大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)和Racine評(píng)分Tab.1 The epileptic seizure frequency and Racine score in different groups ±s

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05；與癲癇1 d組比較，#P＜0.05

1 d 3 d 7 d組別對(duì)照組癲癇組次數(shù)0 12.7±1.9*評(píng)分0.8±0.42 4.2±0.41*次數(shù)0 19.5±2.4*#評(píng)分0.7±0.48 4.9±0.56*次數(shù)0 16.3±3.3*評(píng)分0.9±0.31 4.6±0.51*

2.2 癲癇后大鼠海馬MMP-9蛋白表達(dá)升高 海馬組織免疫熒光顯示，與對(duì)照組比較，癲癇造模后1、3、7 d海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞MMP-9均呈強(qiáng)陽性表達(dá)，其中造模后3 d海馬MMP-9免疫熒光陽性反應(yīng)最強(qiáng)（圖1A、B）。免疫陽性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，癲癇組顯著高于對(duì)照組，并且癲癇3 d組MMP-9陽性（圖1C）。這些結(jié)果表明，海馬區(qū)MMP-9蛋白表達(dá)與造模后癲癇發(fā)作程度變化一致，并呈時(shí)間相關(guān)性。細(xì)胞數(shù)顯著高于1、7 d組（圖1B）。Western blot結(jié)果也顯示，癲癇1、3、7 d海馬MMP-9蛋白表達(dá)均高于對(duì)照組，并且造模后3 d顯著高于造模后1和7 d

圖1 癲癇造模后大鼠海馬內(nèi)MMP-9蛋白表達(dá)Fig.1 MMP-9 protein expression in hippocampus after epilepsy molding

圖2 癲癇造模后大鼠海馬ASK1蛋白表達(dá)及其磷酸化Fig.2 The expression and phosphorylation of ASK1 in hippocampus after epilepsy molding

2.3 癲癇后大鼠海馬ASK1蛋白磷酸化水平升高Western blot檢測(cè)癲癇造模后不同時(shí)間大鼠海馬ASK1蛋白磷酸化水平（P-ASK1）變化。結(jié)果顯示，癲癇造模后1、3和7 d后，大鼠海馬ASK1蛋白表達(dá)無顯著增加，但其磷酸化水平與對(duì)照組相比呈不同水平的升高（P＜0.05，圖2）。其中，造模后3 d其ASK1的磷酸化水平的增加最為顯著，與1和7 d組相比差異具有顯著性（P＜0.05，圖2）。

2.4 癲癇后ASK1磷酸化調(diào)控海馬MMP-9表達(dá)為研究明確ASK1激活對(duì)MMP-9表達(dá)的影響，分別采用ASK1特異抑制劑ML365和MMP-9特異抑制劑GM6001處理癲癇模型動(dòng)物3 d。結(jié)果顯示，ML365顯著抑制了大鼠海馬中ASK1的磷酸化（PASK1），并顯著抑制了MMP-9在海馬的表達(dá)（P＜0.05，圖3）。另一方便，GM6001雖然顯著抑制了MMP-9的表達(dá)，但對(duì)ASK1的磷酸化無明顯影響（P＞0.05，圖 3）。

2.5 抑制ASK1和MMP-9對(duì)癲癇發(fā)作的影響 應(yīng)用ASK1和MMP-9特異抑制劑ML365和GM6001處理癲癇模型動(dòng)物3 d，觀察對(duì)動(dòng)物癲癇發(fā)作的影響。改良Racine評(píng)分結(jié)果顯示，抑制ASK1顯著降低了大鼠癲癇發(fā)作次數(shù)和Racine評(píng)分（P＜0.05，圖4A）。同ASK1抑制劑相似，與癲癇組相比，MMP-9抑制劑GM6001也顯著降低了動(dòng)物的癲癇發(fā)作次數(shù)和Racine評(píng)分（P＜0.05，圖4B）。這些結(jié)果表明，ASK1磷酸化及其引起的海馬MMP-9表達(dá)和活性升高，在TLE發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用。

圖3 癲癇造模中抑制ASK1磷酸化對(duì)海馬MMP-9表達(dá)的影響Fig.3 The effect of ASK1 inhibition on MMP-9 expression in hippocampus in epilepsy rats

圖4 抑制ASK1和MMP-9對(duì)癲癇發(fā)作的影響Fig.4 Effects of ASK1 and MMP-9 inhibition on epileptic seizure

3 討論

鋰-匹羅卡品癲癇模型中，全身炎癥反應(yīng)和血腦屏障的破壞參與了慢性癲癇病灶的形成［3-4］。基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是一類鋅依賴性內(nèi)肽酶，以酶原形式存在于細(xì)胞外基質(zhì)中。先前的研究表明，MMP-9表達(dá)上調(diào)參與了多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)病理和損失過程，如腦缺血、缺血再灌注損傷、腦梗死后出血性轉(zhuǎn)化、肌萎縮側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化、中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病、帕金森病和阿爾茨海默病［6-9］。MMP-9可能通過多種途徑參與了癲癇的發(fā)病過程。急性期中性粒細(xì)胞分泌MMP-9激活后能降解血管基底膜，增加血腦屏障通透性，促進(jìn)外周炎癥因子進(jìn)入腦內(nèi)，激活腦內(nèi)免疫反應(yīng)［10-11］。此外，在鋰-匹羅卡品癲癇模型中，急性期增高的MMP-9可能誘導(dǎo)了海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡參與癲癇病灶的形成［12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，MMP-9在癲癇發(fā)作后表達(dá)上調(diào)，其動(dòng)態(tài)表達(dá)變化過程與癲癇發(fā)作程度一致，并呈時(shí)間相關(guān)性，進(jìn)一步提示MMP-9參與了癲癇慢性病灶的形成。

癲癇急性發(fā)作期全身炎癥反應(yīng)，中性粒細(xì)胞分泌MMP-9攻擊基底膜蛋白破壞了血腦屏障［3，10］。但是有研究表明癲癇發(fā)作急性期血腦屏障的破壞是短暫的，急性發(fā)作后30 min血腦屏障的破壞增加，到發(fā)作后4 h血腦屏障恢復(fù)［13］。也有研究認(rèn)為，鋰-匹羅卡品癲癇模型中血腦屏障的損害與神經(jīng)損害無明顯關(guān)系［3］。筆者推測(cè)急性發(fā)作期后雖然血腦屏障有一定程度的恢復(fù)，但是由于腦內(nèi)免疫反應(yīng)激活，在炎性因子，如IL-1β、TNF-α等的作用下MMP-9表達(dá)仍持續(xù)增多，導(dǎo)致繼發(fā)性損害，包括影響突觸重塑功能，誘導(dǎo)神經(jīng)元變性壞死，參與膠質(zhì)瘢痕形成。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)在海馬區(qū)MMP-9表達(dá)3 d達(dá)高峰后逐漸降低，可能是與癲癇發(fā)作后該區(qū)域錐體細(xì)胞變性死亡有關(guān)。

ASK1是腦損傷后立即激活的一種主要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子。在多種中樞損傷和病理進(jìn)程中，ASK1可被細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激激活，包括腦缺血性中風(fēng)、亨廷頓病和阿爾茲海默病［14］。先前的研究顯示，腦損傷時(shí)ASK1的激活可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，而干擾抑制ASK1的表達(dá)可減輕腦損傷［15］。此外，ASK1被證明參與調(diào)節(jié)多種血管功能。例如，ASK1可調(diào)控血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和aquaporin-1的表達(dá)，參與血管通透性和水平衡的調(diào)節(jié)。基因芯片的研究結(jié)果也顯示，ASK1表達(dá)沉默可降低多種腦血管細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，包括Cdh1、Icam1、Gjb3和Sele，分別為鈣黏素1、細(xì)胞間黏附分子1和縫隙連接蛋白β1的表達(dá)基因［16］。最新的研究顯示，在腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中，抑制ASK1激活可直接降低MMP-9的蛋白表達(dá)和活性［5］。本研究結(jié)果顯示，海馬ASK1磷酸化水平在癲癇造模后顯著升高，其磷酸化水平變化趨勢(shì)與MMP-9和癲癇發(fā)作程度變化一致。并且ASK1特異抑制劑顯著降低了癲癇后海馬MMP-9的表達(dá)水平，表明癲癇狀態(tài)下，ASK1信號(hào)的激活引起了MMP-9的表達(dá)上調(diào)。此外，ASK1抑制劑和MMP-9抑制劑都可有效的減輕動(dòng)物的癲癇發(fā)作程度，表明ASK1信號(hào)的激活及其導(dǎo)致的MMP-9表達(dá)上調(diào)在癲癇發(fā)病進(jìn)程中發(fā)揮了重要作用。

綜上所述，本研究探討了鋰-匹羅卡品癲癇模型中海馬MMP-9的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化，以及ASK1激活及其對(duì)MMP-9表達(dá)和活性的調(diào)控作用，揭示了癲癇病灶中MMP-9表達(dá)上調(diào)的分子機(jī)制。并且通過應(yīng)用抑制劑，證明ASK1-MMP-9信號(hào)通路在TLE發(fā)生過程中可能發(fā)揮了重要作用，為進(jìn)一步闡明TLE發(fā)生的機(jī)制和癲癇的臨床治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］洪震.癲癇流行病學(xué)研究［J］.中國現(xiàn)代神經(jīng)疾病雜志，2014，14（11）：919-923.

［2］黃效東，楊新華，盧永輝.白藜蘆醇通過抑制CREB磷酸化減輕癲癇發(fā)作并改善認(rèn)知功能［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2017，33（1）：72-75.

［3］HAN H，MANN A，EKSTEIN D，et al.Breaking bad：the structure and function of the blood-brain barrier in epilepsy［J］.AAPS J，2017，19（4）：973-988.

［4］BRONISZ E，KURKOWSKA-JASTRZEBSKA.Matrix metalloproteinase 9 in epilepsy：The role of neuroinflammation in seizure development［J］.Mediators Inflamm，2016，2016（2）：12-26.

［5］CHEON S Y，CHO K J，KIM S Y，et al.Blockade of apoptosis signal-regulating kinase 1 attenuates matrix metalloproteinase 9 activity in brain endothelial cells and the subsequent apoptosis in neurons after ischemic injury［J］.Front Cell Neurosci，2016，10：213.

［6］KUROKI T，TANAKA R，SHIMADA Y，et al.Exendin-4 inhibits matrix metalloproteinase-9 activation and reduces infarct growth after focal cerebral ischemia in hyperglycemic mice［J］.Stroke，2016，47（5）：1328-1335.

［7］VALADO A，LEIT?O M J，MARTINHO A，et al.Multiple sclerosis：Association of gelatinase B/matrix metalloproteinase-9 with risk and clinical course the disease［J］.Mult Scler Relat Disord，2017，11：71-76.

［8］DANG B，DUAN X，WANG Z，et al.A therapeutic target of cerebral hemorrhagic stroke：matrix metalloproteinase-9［J］.Curr Drug Targets，2017，18（12）：1358-1366.

［9］KAMINARI A，GIANNAKAS N，TZINIA A，et al.Overexpression of matrix metalloproteinase-9（MMP-9）rescues insulin-mediated impairment in the 5XFAD model of Alzheimer′s disease［J］.Sci Rep，2017，7（1）：683.

［10］BANKS W A，ERICKSON M A.The blood-brain barrier and immune function and dysfunction［J］.Neurobiol Dis，2010，37（1）：26-32.

［11］YONG V W，POWER C，F(xiàn)ORSYTH P，et al.Metalloproteinases in biology and pathology of the nervous system［J］.Nat Rev Neurosci，2001，2（7）：502-511.

［12］KIM G W，KIM H J，CHO K J，et al.The role of MMP-9 in integrin-mediated hippocampal cell death after pilocarpine-induced status epilepticus［J］.Neurobiol Dis，2009，36（1）：169-180.

［13］SULEYMANOVA E M，GULYAEV M V，ABBASOVA K R.Structural alterations in the rat brain and behavioral impairment after status epilepticus：An MRI study［J］.Neuroscience，2015，315（4）：79-90.

［14］KAWARAZAKI Y，ICHIJO H，NAGURO I.Apoptosis signalregulating kinase 1 as a therapeutic target［J］.Expert Opin Ther Tar，2014，18（6）：651-664.

［15］KIM H W，CHO K J，LEE S K，et al.Apoptosis signal regulating kinase 1（Ask1）targeted small interfering RNA on ischemic neuronal cell death［J］.Brain Res，2011，1412：73-78.

［16］SONG J，CHEON S Y，LEE W T，et al.The effect of ASK1 on vascular permeability and edema formation in cerebral ischemia［J］.Brain Res，2015，1595：143-155.