鳳仙花和馬齒莧水提取物對(duì)常見皮膚癬菌的體外抑菌試驗(yàn)

張伊娜　劉英超

【摘要】 目的：觀察鳳仙花和馬齒莧水提取液對(duì)紅色毛癬菌、須癬毛癬菌兩種皮膚癬菌的體外抑菌作用。方法：采用瓊脂打孔法觀察鳳仙花和馬齒莧水提取液抗真菌的藥效，通過微量液體稀釋法測(cè)定其對(duì)兩種皮膚癬菌的最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）。結(jié)果：鳳仙花和馬齒莧水提取液對(duì)兩種皮膚癬菌均有抑制作用，鳳仙花水提取液對(duì)紅色毛癬菌的MIC、MBC值分別為31.25、62.5 mg/ml，對(duì)須癬毛癬菌的MIC、MBC值分別為62.5、125.0 mg/ml，馬齒莧水提取液對(duì)紅色毛癬菌的MIC、MBC值分別為62.5、62.5 mg/ml，對(duì)須癬毛癬菌的MIC、MBC值分別為62.5、125 mg/ml。

結(jié)論：鳳仙花和馬齒莧水提取液中含有抑皮膚癬菌活性成分。

【關(guān)鍵詞】 鳳仙花； 馬齒莧； 水提取物； 皮膚癬菌； 抑菌試驗(yàn)

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.9.004 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1674-6805（2018）09-0008-02

Experiment of Antifungal Activities in Vitro in Water Extraction of Impatiens Balsamina L. and Portulacaoleracea L./ZHANG Yina，LIU Yingchao.//Chinese and Foreign Medical Research，2018，16（9）：8-9

【Abstract】 Objective：To observe the effects of Impatiens balsamina L. and Portulacaoleracea L. water extraction against Trichophyton rubrum and Trichophyton mentagrophytes in vitro.Method：The agar hole diffusion test was used to observe the effects of the antifungal activitiesin water extraction of Impatiens balsamina L. and Portulacaoleracea L..The minimum inhibitory concentration （MIC） and minimum bactericidal concentration（MBC）were determined by the microdilution method.Result：The in vitro assay showed that both water extraction of Impatiens balsamina L. and Portulacaoleracea L. exhibited inhibitory effects on Trichophyton rubrum and Trichophyton mentagrophytes.The MIC and MBC of Impatiens balsamina L. water extraction against Trichophyton rubrum were 31.25 mg/ml and 62.5 mg/ml，the MIC and MBC of Impatiens balsamina L. water extraction against Trichophyton mentagrophytes were 62.5 mg/ml and 125 mg/ml.The MIC and MBC of Portulacaoleracea L. water extraction against Trichophyton rubrum were 62.5 mg/ml and 62.5 mg/ml，the MIC and MBC of Portulacaoleracea L. water extraction against Trichophyton mentagrophytes were 62.5 mg/ml and 125 mg/ml.Conclusion：Impatiens balsamina L. and Portulacaoleracea L. water extraction contains antifungal ingredients against dermatophytes.

【Key words】 Impatiens balsamina L.； Portulacaoleracea L.； Water extraction； Dermatophytes； Antifungal experiment

First-authors address：Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，China

皮膚癬菌引起的淺部真菌感染是皮膚科最常見的皮膚病[1]，近年來臨床常用的抗真菌藥物雖然發(fā)揮較大作用，但其肝腎毒性、耐藥性等也有一些臨床報(bào)道[2]。由于中草藥具有副作用小、價(jià)格低廉、耐藥性產(chǎn)生少等特點(diǎn)，使得人們對(duì)抗真菌中草藥越來越重視。本試驗(yàn)主要研究鳳仙花（Impatiens balsamina L.）和馬齒莧（Portulacaoleracea L.）水提取物對(duì)淺部真菌感染中較常見的皮膚癬菌的抑菌效果，以評(píng)價(jià)鳳仙花和馬齒莧水提取物抗真菌的藥效。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 紅色毛癬菌（Trichophyton rubrum，ATCC28188）

1株、須癬毛癬菌（T. m entagrophytes，ATCC9533）1株，均由上海瑞楚生物科技有限公司菌種保藏中心提供。

1.1.2 試驗(yàn)藥品 鳳仙花、馬齒莧購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)門診部。鳳仙花和馬齒莧水提取物的制備：稱取干燥的鳳仙花和馬齒莧分別粉碎成粗粉，各取粗粉100 g，加入適量蒸餾水浸泡0.5 h，然后加熱至沸騰，繼續(xù)煮沸1 h后過濾。取藥渣再加入適量蒸餾水，同樣加熱至沸騰，煮沸1 h后過濾，合并兩次濾液，用文火加熱濃縮，藥液濃度均為1 g/ml，作為儲(chǔ)備藥液。測(cè)定MIC和MBC值前將鳳仙花和馬齒莧儲(chǔ)備藥液用無菌的蒸餾水溶解，并稀釋成10個(gè)濃度梯度，2種中藥水提取物的最終濃度均分別為1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.813、3.906、1.953 mg/ml。

1.1.3 培養(yǎng)基 沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）：取蛋白胨10 g、葡萄糖40 g、氯霉素0.2 g、瓊脂20 g，加蒸餾水1 000 ml，加熱溶解后，分裝，經(jīng)121 ℃滅菌15 min，備用（若是沙氏液體培養(yǎng)基則不加瓊脂）[3]。

1.2 方法

1.2.1 活化菌株 真菌用SDA培養(yǎng)，溫度為28 ℃，活化2次。

1.2.2 制作菌懸液 挑取約芝麻粒大小的菌落，溶于1 ml經(jīng)滅菌的蒸餾水后充分混合均勻，調(diào)節(jié)菌懸液的濁度為（0.5～1）麥?zhǔn)蠞岫龋喈?dāng)于5×106～10×106 CFU/ml[4]。

1.2.3 瓊脂打孔法 用直徑9 cm培養(yǎng)皿，加入熔化培養(yǎng)液20 ml，制作成SDA平板，用無菌的玻璃涂布棒將各菌懸液100 μl均勻涂布于各培養(yǎng)基平板表面，蓋好培養(yǎng)皿后在室溫條件下放置于超凈工作臺(tái)。每株菌3個(gè)培養(yǎng)皿。待平板表面稍干，用直徑7 mm的打孔器在涂菌后的培養(yǎng)基上各打孔2個(gè)，將孔內(nèi)瓊脂挑去后分別用微量取樣器吸取濃度為1 g/ml的鳳仙花、馬齒莧水提取液加入孔內(nèi)，藥液與孔的邊緣平齊并充分接觸，勿使藥液沾染孔外的瓊脂平面[5]。每種水提取液3個(gè)培養(yǎng)皿，一共6個(gè)培養(yǎng)皿，置于28 ℃中培養(yǎng)，7 d后觀察并測(cè)量各孔周圍抑菌圈大小，記錄其直徑，每孔的抑菌圈直徑取其最大徑和最小徑的均數(shù)。

1.2.4 最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）測(cè)定 參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）提出的對(duì)絲狀真菌的藥物敏感方案[6]，采用微量液體稀釋法測(cè)定2種藥液對(duì)不同菌株的MIC值；采用SDA平板涂布法測(cè)定2種藥液對(duì)不同菌株的MBC值[7]。取無菌96孔平底微量培養(yǎng)板，于每排第1～12孔加入100 μl沙氏液體培養(yǎng)液，再于每排第1～10孔分別加入倍比稀釋的藥液（100 μl/孔），然后于每排第1～11孔加入上述菌懸液100 μl，其中每排第11孔只加培養(yǎng)液100 μl和菌懸液100 μl作為陽性對(duì)照，第12孔只加培養(yǎng)液100 μl和藥液100 μl作為陰性對(duì)照，然后將培養(yǎng)板振蕩5 min，使液體充分混勻，置于28 ℃中培養(yǎng)，7 d后觀察結(jié)果，并測(cè)定其MIC值。確定MIC值后，在上述藥敏板所有清晰無菌生長的孔中用涂布棒蘸取藥液，涂布于SDA平板，經(jīng)28 ℃培養(yǎng)7 d，以平板上菌落數(shù)不超過5個(gè)的最低藥物濃度作為該藥物對(duì)該菌株的MBC值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

鳳仙花和馬齒莧水提取液對(duì)兩種皮膚癬菌的抑菌圈直徑大小、MIC和MBC測(cè)定結(jié)果可知鳳仙花和馬齒莧水提取液對(duì)紅色毛癬菌和須癬毛癬菌均有較強(qiáng)的抑制作用。比較兩種皮膚癬菌抑菌圈直徑大小，發(fā)現(xiàn)無論是鳳仙花水提取液還是馬齒莧水提取液，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；且鳳仙花和馬齒莧水提取液對(duì)同一種皮膚癬菌的抑菌圈直徑的比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。鳳仙花水提取液對(duì)紅色毛癬菌的MIC和MBC分別為31.25 mg/ml和62.5 mg/ml，對(duì)須癬毛癬菌的MIC和MBC分別為62.5 mg/ml和125 mg/ml；馬齒莧水提取液對(duì)紅色毛癬菌的MIC和MBC分別為62.5 mg/ml和62.5 mg/ml，對(duì)須癬毛癬菌的MIC和MBC分別為62.5 mg/ml和125 mg/ml，見表1。

3 討論

鳳仙花為鳳仙花科鳳仙花屬一年生草本植物，性溫味甘，具有祛風(fēng)除濕、活血止痛、解毒等功效，常用于治療關(guān)節(jié)風(fēng)濕痛、腰痛、婦女閉經(jīng)腹痛、產(chǎn)后瘀血未盡、跌打損傷、白帶、灰指甲等。馬齒莧為馬齒莧科馬齒莧屬一年生草本植物，性寒味酸，具有清熱解毒、涼血止血之功效，常用于治療熱痢膿血、帶下色黃、濕疹、丹毒等[8-9]。近年來國內(nèi)對(duì)鳳仙花和馬齒莧的研究主要集中在其化學(xué)成分及藥理活性方面，而有關(guān)其抗皮膚癬菌作用的報(bào)道較少。本研究選取了淺部真菌感染中較常見的紅色毛癬菌和須癬毛癬菌，來探究鳳仙花、馬齒莧水提物對(duì)這兩種皮膚癬菌的抑制作用，為將其開發(fā)為臨床制劑提供試驗(yàn)依據(jù)。從試驗(yàn)結(jié)果來看，鳳仙花和馬齒莧水提取液對(duì)紅色毛癬菌和須癬毛癬菌均具有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌作用隨濃度增高而增強(qiáng)。研究表明，鳳仙花和馬齒莧均含有豐富的化學(xué)成分，如鳳仙花含有黃酮類、萘醌類、香豆素類及甾醇類等成分[10]，馬齒莧含有萜類、生物堿類、多糖類、香豆素類、有機(jī)酸類、黃酮類、甾體類等成分[11]，這兩種中草藥的抗真菌作用可能與其某一或多種化學(xué)成分有關(guān)，但有關(guān)具體的抑菌成分，還需要進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2017-10-23）