HPLC-DAD法測定藍花參中橙皮苷含量

文清

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院，福建 福州 350003；2.福建職業(yè)衛(wèi)生技術(shù)學(xué)院，福建 福州 350101;3. 福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院附屬福建省級機關(guān)醫(yī)院，福建 福州 350003

藍花參(Wahlenbergiamarginata(Thunb.) A. DC.)為桔梗科藍花參屬的植物，入藥部位為根或全草，具有益氣健脾、祛痰止咳的功效，臨床上常用于治療氣管炎、百日咳[1]等疾病。目前發(fā)現(xiàn)藍花參中含有甾體類化合物如β-谷甾醇葡萄糖苷、多炔類化合物如黨參炔苷、苯丙素類化合物如Wahlenbergioside及揮發(fā)油如n-十六烷酸[2-4]等化學(xué)成分。橙皮苷為課題組首次于藍花參中發(fā)現(xiàn)的黃酮類物質(zhì)，其相對分子量為610.56 kD[5]。大量的研究表明[6]，橙皮苷在抗腫瘤、心血管保護、神經(jīng)保護及過敏性哮喘等方面皆有良好的治療效果。本實驗利用高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)法測定藍花參中橙皮苷含量，為建立快速準確測定藍花參中的橙皮苷提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters H-class高效液相色譜儀(配有在線脫氣機、四元泵、自動進樣器，美國Waters公司)；SB-5200DT超聲波提取器(寧波新芝生物科技股份有限公司，批號：131897)；BSA224S電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，批號：2014-03)。

1.2 材料 藍花參全草干品購于福州回春中藥飲片廠有限公司(批號：14010507)，經(jīng)福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)系朱扶蓉副教授鑒定為[Wahlenbergia marginata(Thunb.) A.DC.]。

橙皮苷對照品(批號：K02M3C1，上海源葉生物科技有限公司)，HPLC級乙腈(批號：20150402)、甲醇(批號：20160411，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；AR，級乙酸(批號：0812181)、甲酸(批號：1608241，汕頭市西隴化工廠有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 流動相乙腈(A)-1%乙酸水(B)，梯度洗脫(0～1 min，5%～15%A；1～4 min，15%～20%A；4～7 min，20%～25%A；7～10 min，25%～30%A；10～13 min，30%～35%A；13～16 min，35%～40%A；16～20 min，40%～60%A；20～23 min，60%～70%A)；流速：0.3 mL/min；檢測波長268 nm；柱溫30 ℃；進樣量2 μL。見圖1所示。

2.2 對照品溶液制備 精密稱定橙皮苷對照品1.036 mg于10 mL容量瓶中，加入甲醇，超聲溶解，定容，得到濃度為1.036 mg/mL的對照品貯備液。

2.3 供試品溶液制備 精密稱定藍花參藥材約2.0 g，精密加入40%乙醇50 mL，稱定重量，超聲30 min(250 W、50 Hz)后取出，放至室溫，補足重量，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 標準曲線制備 精密量取橙皮苷對照品溶液適量，稀釋成一系列對照品溶液，按2.1項下色譜條件測定，以對照品溶液濃度(C)為橫坐標x，峰面積(A)為縱坐標y，得回歸方程：y=0.101x+0.401(r=0.9965)，線性范圍為4.144～82.88 μg/mL。如圖2所示。

2.5 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液2 μL，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進樣6次。橙皮苷峰面積RSD為0.35%，橙皮苷保留時間(tR)RSD為0.14%，表明該儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 精密稱定藍花參藥材約2.0 g，按“2.3”項下制備供試品溶液，于0，1，2，4，8，12 h，按“2.1”項下色譜條件進樣。橙皮苷峰面積RSD為0.51%，說明該供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗 精密稱定藍花參藥材約2.0 g，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣，平行操作6次。橙皮苷的平均含量為698.209 μg/g，RSD為0.47%，說明該方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取同批藍花參藥材6份，每份約1.0 g，均精密加入橙皮苷對照品溶液適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣。橙皮苷的平均加樣回收率為97.63%，RSD為1.39%。說明該方法準確性高。見表1。

表1 橙皮苷加樣回收率試驗結(jié)果

2.9 樣品測試 精密稱取藍花參2 g，平行3份，按照“2.3“項下制備供試品溶液，按”2.1”項下色譜條件分別對3份樣品進行測定，橙皮苷含量分別為681.221 μg/g、675.365 μg/g、684.981 μg/g，平均值為680.522 μg/g，RSD為0.62%。

3 討論

文獻報道[7]橙皮苷具有較強的抗炎作用，對4種炎癥模型均表現(xiàn)出劑量依賴性的抑制作用，而藍花參經(jīng)實驗證實其高、中劑量均具有抗炎消腫作用[8]。由此推斷橙皮苷有可能是其抗炎活性物質(zhì)基礎(chǔ)之一，其具體作用機制有待進一步實驗證。

藍花參中橙皮苷的含量測定未見文獻報道，故試驗采用HPLC-DAD法對藍花參中橙皮苷含量進行快速檢測，該法簡便易行，且精密度、準確性、重復(fù)性均良好，為建立快速準確測定藍花參中的橙皮苷提供依據(jù)。

參考文獻

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[2]張宗平，賈忠建，朱子清.細葉沙參化學(xué)成分的研究[J].蘭州大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，1987，23(4)：159-160.

[3]W. G. M A, Tan R X, Fuzzati N, et al. Cheminform Abstract: Wahlenbergioside, a Phenylpropanoid Glucoside from Wahlenbergia marginata[J]. Phytochemistry, 1997, 45(2):411-415.

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[5]曾茂貴，張寬，羅蘭.基于HPLC-DAD-Q-TOF-MS的藍花參化學(xué)成分定性研究[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2017，37(11)：23-28.

[6]李雪飛，江洪.橙皮苷藥理學(xué)作用機制及研究進展[J].海南醫(yī)學(xué)，2016，27(14)：2337-2340.

[7]李榮，胡成穆，姜輝，等.橙皮苷的提取及其抗炎活性研究[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2007，42(5)：546-549.

[8]葉華，曾茂貴，羅戢彬凱，等.藍花參抗炎、止痛的藥效學(xué)與急性毒性試驗研究[J].福建中醫(yī)藥，2012，43(5)：49-50，55.