基于疏水性抗腫瘤藥物載體構建超分子水凝膠

林曉曉，蔡喆，林光勇

（溫州醫科大學附屬第二醫院 藥學部，浙江 溫州 325027）

水凝膠因其自身的特性（良好的生物相容性、力學特性、水滲透性及表面特性等）使其（溫度、pH值、光等刺激-響應性超分子水凝膠）在生物醫學領域具有廣泛的應用[1-3]，超分子水凝膠是一類物理水凝膠，它是由化合物分子通過分子間的非共價相互作用（例如氫鍵作用、疏水作用、π-π堆積作用、靜電作用、金屬離子配位作用以及主客體作用等）在水溶液中自聚集形成的，具有良好的可降解性和觸變性，被廣泛應用于可注射藥物載體等方面的研究[4-6]。環糊精（cyclodextrin，CD）是一類由D-吡喃葡萄糖單元通過α-1，4糖苷鍵首尾相連而成的大環化合物，用于疏水性藥物的負載和控釋研究[7-8]，合用水凝膠，可望改善水凝膠中藥物攜載量和緩釋行為。但是到目前為止，基于CD主客體包合物的超分子水凝膠親水性藥物及生物大分子的緩釋，僅有少數的報道是關于抗腫瘤藥物的運載。

本研究利用己內酯化學修飾的聚乙二醇前藥分子（MPEG5000-PCL5000）與α-環糊精（α-CD）的主客體相互作用，將疏水性抗癌藥物紫杉醇（paclitaxel，PTX）原位包埋于水凝膠中。同時通過流變、電鏡、X射線衍射（X-ray diffraction，XRD）等測試手段研究凝膠體系的微觀結構、理化特征、體外釋藥行為等，初步探索超分子水凝膠作為抗腫瘤藥物載體的可行性。

1 材料和方法

1.1 材料 聚乙二醇單甲醚（monomethyl polyethylene ether glycol，MPEG，相對分子質量5 kDa）、辛酸亞錫[Sn（Oct）2]和ε-己內酯（ε-CL）購自美國Sigma公司。MPEG5000-PCL5000嵌段共聚物（MPEG/PCL=5 000/5 000；相對分子質量10 kDa）的合成參照本課題之前的研究[9]。通過疏水性熒光探針測得文中所用MPEG5000-PCL5000嵌段共聚物的膠束濃度（critical micelle concentration，CMC）為0.000457 g/L（見圖1）。α-CD和PTX購自德國J&K科技有限公司。DMEM培養基購自美國Gibco公司。所有溶劑皆為分析純，直接使用。

圖1 MPEG5 000-PCL5 000嵌段共聚物的I337/I334與log C強度比值圖

1.2 膠束的制備與表征 膠束的合成參照文獻[10]的共沉淀方法。將1.8 g MPEG5000-PCL5000嵌段共聚物和0.2 g PTX一起溶解于10 mL丙酮溶液，攪拌均勻后，再通過真空旋蒸除去多余的有機溶劑，可得到透明質膠。再把此透明質膠重新溶解于20 mL 55 ℃去離子水中，反應結束后將其過濾除去不溶物，得到含PTX的MPEG5000-PCL5000膠束，產物于-50 ℃條件下凍干。PTX的MPEG5000-PCL5000膠束中載藥量測定：采用高速離心法測定藥物PTX載藥量，取一定量含PTX的MPEG5000-PCL5000膠束凍干粉，蒸餾水復溶。膠束溶液經100 000×g離心50 min，HPLC測定上清液中PTX含量。PTX載藥量的計算公式為：

PTX載藥量（%）=[mPTX（總）-mPTX（上清）]/[mPTX（總）+mMPEG5000-PCL5000]×100% （ 公式一）

1.3 載藥超分子凝膠的制備 將一定質量的含PTX的MPEG5000-PCL5000膠束[20%（w/v）（]w/v為質量濃度為200 g/L的PTX）與α-CD[20%、15%和10%（w/v）]分別溶解于蒸餾水中，然后將兩者等體積混合，室溫條件下攪拌均勻并靜置過夜，凝膠逐漸形成。同時用反向試管法測凝膠時間[11]。

1.4 載藥超分子凝膠的表征

1.4.1 XRD：凍干后的凝膠樣品的XRD表征采用Bruker AXS/D8型XRD儀，銅靶（Cu），設定激發電壓40 kV，電流40 mA，掃描范圍2θ=5°～60°。

1.4.2 掃描電子顯微鏡：利用掃描電子顯微鏡（s-4800，日本日立公司）對凍干后的凝膠樣品的形態學變化進行監測。

1.4.3 流變性質：樣品的流變性質采用AR-2000高級流變擴展系統（美國TA儀器公司）進行表征，采用40 mm平行板夾具，水浴控溫于25 ℃。樣品的凝膠化動力學采用動態時間掃描模式進行表征，掃描范圍為0.1～100 rad/s；凝膠樣品的觸變性采用穩態剪切掃描和觸變環掃描進行表征，穩態剪切掃描時其速率范圍為0.01～10/s。

1.5 體外釋放實驗 在透析袋（3 500 kDa）中加入1 mL含PTX的超分子凝膠溶液，待凝膠成型后，將透析袋浸入含5 mL PBS緩沖釋放介質試管中，然后將試管置于37 ℃的恒溫振蕩水浴箱中進行體外釋放實驗，振蕩速率為100次/min。分別在不同時間點，從試管的釋放介質中小心取出1 mL釋放介質，剩下的4 mL丟棄，然后將新鮮的5 mL PBS補加到試管中繼續實驗。利用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC，美國Agilent公司，反相C18柱子，直徑×高為4.6 mm×150 mm，填料粒徑為5 μm）測量釋放液在227 nm處的吸光度，計算得到MPEG5000-PCL5000的體外釋放曲線。HPLC檢測時流動相為乙腈/水=45/55（v/v），流速為1 mL/min。

1.6 體外細胞實驗 PTX用DMSO溶解，含PTX的超分子水凝膠用PBS溶解，α-CD用水溶解，所有溶液均用0.22 μm的濾膜過濾除菌。收集對數期肺癌細胞（A549），調整細胞懸液濃度，然后將細胞種于96孔平底板中，將待測細胞密度調至1×104個/孔。將細胞在5% CO2、37 ℃條件下孵育24 h，使細胞貼壁呈單層生長。然后向每孔加入適當濃度藥物樣品，使藥物樣品的終濃度在0.001～1 μg/mL。將細胞在5% CO2、37 ℃條件下繼續培養48 h后，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），繼續培養4 h。然后終止培養，小心吸去孔內的培養液，每孔加入100 μL DMSO，置于搖床上低速振蕩10 min，使結晶物充分溶解。在570 nm處測量各孔的吸光度值。

1.7 統計學處理方法 采用SPSS10.0統計軟件進行數據分析。計量資料以±s表示，樣本均數之間的比較采用方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 膠束的制備與表征 MPEG5000-PCL5000膠束和含PTX的MPEG5000-PCL5000膠束均呈乳白色，但是它們的平均尺寸是不一樣的，分別為（99.56±1.03）nm和（103.67±2.12）nm（見圖2）。載藥量實驗測定結果表明，PTX的MPEG5000-PCL5000膠束的最大載藥量是18.8%。圖3所示的XRD圖譜證實了PTX確實已被成功地包合進MPEG5000-PCL5000中，在含PTX的MPEG5000-PCL5000膠束中，PTX的特征峰消失了。

2.2 超分子凝膠的制備 如圖4所示，將含PTX的MPEG5000-PCL5000溶液與α-CD溶液在室溫條件下混合均勻，體系靜置一段時間后可形成倒置不流動的凝膠。反向試管法實驗結果表明α-CD/MPEG5000-PCL5000凝膠所需要的時間依賴于體系中α-CD的數量（見表1），當CD的數量由5%增加到10%（w/v）時，凝膠時間由～45 min減少到～8 min。重要的是，所獲得的超分子水凝膠無論是在室溫或者4 ℃保存7 d，其膠的形態并不會發生改變，該結果表明本研究所制備的超分子水凝膠是熱不敏感型的凝膠。

圖3 PTX和含PTX的MPEG5 000-PCL5 000膠束的XRD圖譜

圖4 MPEG5 000-PCL5 000膠束和αCD在水溶液中通過包合作用形成超分子水凝膠

表1 在相同體積的α-CD/MPEG5 000-PCL5 000中混合和凝膠結果

2.3 表征

2.3.1 XRD分析：圖5所示的XRD圖譜證實了凝膠結構中這種超分子結構的形成，與單純的MPEG5000-PCL5000在2θ=19.2°、21.3°和23.3°處出現了PEG和PCL的特征結晶峰不同，凝膠樣品在2θ=11.8°、19.2°、21.7°和23.3°處出現了特征衍射峰。

2.3.2 電鏡觀察：如圖6所示，本研究所制備的超分子水凝膠凍干后進行掃描電鏡觀察，發現空白和載藥的超分子水凝膠均具有多孔結構，孔徑大小在100～150 μm，這種結構保證了藥物能夠通過擴散的方式進行釋放。

圖5 MPEG5 000-PCL5 000膠束、α-CD和凍干的α-CD/MPEG5 000-PCL5 000水凝膠的XRD圖譜

圖6 超分子水凝膠凍干品的掃描電鏡圖像

2.3.3 流變性質：為研究CD數量對超分子凝膠流變性質的影響，首先對其進行動態應變掃描以確定其線性粘彈范圍。圖7A-C所示為α-CD與MPEG5000-PCL5000通過主客體相互作用形成的超分子水凝膠的典型的動態應變掃描曲線。從圖中可以看出，在起始階段，所有凝膠樣品的粘性模量（G''）均要比彈性模量（G'）要高，這也表明所有的凝膠樣品是處于溶膠的狀態。隨著時間的推移，G'比粘性模量G''增加得更快，導致了2條曲線交叉點的出現，這表明超分子凝膠由溶膠到凝膠的一個轉變。在2條曲線相交的位置，表明由MPEG5000-PCL5000與α-CD形成的凝膠的網絡結構逐漸形成。同時G＞G''，也證實是凝膠的狀態。將G'和G''曲線在某一時刻相交的位置作為凝膠點，對應的時間即為體系的凝膠化時間。研究發現，降低α-CD的含量能增加凝膠化時間。當α-CD的含量為20%（w/v）時凝膠化時間最短（～290 s）。

將超分子水凝膠進行動態頻率掃描，可得到α-CD的濃度對凝膠強度的影響規律。從圖7D可以看出，3個凝膠樣品均是彈性凝膠，剪切速率為0.1～100 rad/s，且G'＞G''。特別是C1凝膠（在100 rad/s時，G'=1 483 Pa）具有最強的彈性，比C2凝膠（在100 rad/s時，G'=1 085 Pa）高1.4倍，比C3凝膠（在100 rad/s時，G'=299 Pa）高4.9倍。如圖7E（25 ℃）和圖8（37 ℃）所示為不同α-CD濃度的超分子水凝膠的剪切粘度隨剪切速率的變化曲線。結果顯示，3個凝膠樣品均表現出類似非牛頓流體的剪切變稀的性質，在較低的剪切速率下表現出較高的粘度：當剪切速率由0/s增加到10/s時，粘度由4 674、4 388、471 Pas逐漸降到0。

圖7 超分子水凝膠的流變性質

圖8 37 ℃條件下不同α-CD濃度剪切粘度隨剪切速率的變化曲線

2.3.4 體外釋放實驗：圖9A所示為不同α-CD濃度的超分子水凝膠對PTX藥物的體外釋放行為。可以看出3個凝膠體系對PTX均有良好的緩釋效果，且釋放過程可持續72 h以上。所有樣品在前24 h均無出現明顯的暴釋現象，隨后轉入持續性的釋放過程，最終水凝膠完全溶解消失，且C4、C5和C6水凝膠的累積釋放量分別為76.3%、89.1%和99.7%。從數據來看，C4、C5和C6水凝膠累積釋放量之間的差異有統計學意義（P＜0.05）。實驗結果表明PTX的釋放速率可以通過α-CD的濃度進行調節。

2.3.5 體外細胞實驗：圖9B所示為超分子水凝膠在不同濃度下釋放出的PTX對A549肺癌細胞的抑制效果。結果顯示，對癌細胞的毒性依賴于PTX的濃度，PTX膠束和PTX水凝膠分別與游離的PTX比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。實驗結果表明PTX膠束和PTX水凝膠延緩了PTX的釋放速度，延長PTX抗腫瘤作用時間。

3 討論

高分子量聚乙二醇（PEG，相對分子質量＞10 kDa）和聚丙二醇與環氧乙烷的加聚物形成的嵌段共聚物可以與α-CD形成可注射超分子水凝膠，而低分子量PEG會與α-CD形成共沉淀[4，12]。有研究表明，α-CD與水溶液狀態的PEG嵌段共聚物可以通過主客體相互作用以及疏水作用形成水凝膠[13-16]。基于此，在本研究中，我們利用MPEG5000-PCL5000與α-CD構建了一類新型的能負載抗腫瘤藥物的超分子水凝膠。研究表明，MPEG5000-PCL5000在凝膠化的過程中占據了不可或缺的地位。首先，MPEG5000-PCL5000具有的兩親性使得其自身就能形成能負載疏水性藥物的膠束。其次，MPEG5000-PCL5000中具有疏水性的PCL鏈段的自聚集對凝膠的形成有誘導作用，且使得超分子水凝膠的性質更加穩定。表1的數據表明，凝膠化時間可通過α-CD濃度調節。體系中α-CD的濃度越高，越能促進MPEG5000-PCL5000中具有疏水性的PCL鏈段的自聚集，因此越能縮短凝膠化時間，且使得超分子水凝膠的性質更加穩定[15]。LIU等[14]研究也發現，以α-CD為主體的水凝膠的凝膠化時間及性質可以通過組分等因素調控。

圖9 超分子水凝膠在不同濃度下釋放出的PTX對A549肺癌細胞的抑制效果

初步的研究表明，在以CD為主體構建的超分子水凝膠中，被部分包含的PEG或者PEO鏈相互聚集，通過α-CD分子之間的氫鍵作用形成微晶區[11，17]。如圖5所示的XRD圖譜證實了凝膠結構中這種超分子結構的形成，凝膠樣品在2θ=19.8°處出現了新峰。因此MPEG5000-PCL5000與α-CD發生的主客體包合作用是形成超分子水凝膠的主要驅動力。圖6所示的形態學的觀察表明超分子水凝膠是一個多孔的結構，且孔徑大小為100～150 μm。并且PTX的負載對其整體結構的影響并不大。

超分子水凝膠流變性質的研究對于凝膠形成（藥物負載）及藥物釋放（注射）過程中膠體結構改變的研究具有十分重要的意義。圖7A-C所示為α-CD與含PTX的MPEG5000-PCL5000通過主客體相互作用形成的超分子水凝膠的動態應變掃描曲線。從圖中可以看出，隨著α-CD濃度的增加，體系的凝膠化時間明顯縮短。該實驗結果與瓶倒轉法實驗所得到的結果是一致的。但是，由于在瓶倒轉法實驗中需要更多的鉸鏈以及更大的凝膠強度，因此，利用流變實驗測得的凝膠化時間要比利用瓶倒轉法測得的時間短[5，11]。圖7E所示為不同α-CD和MPEG5000-PCL5000濃度的超分子水凝膠的模量隨頻率的變化曲線。可以看出，凝膠的彈性模量基本不隨頻率變化，表現出一種“類固體”的性質。隨著剪切的推進，由于α-CD和MPEG5000-PCL5000主客體之間包合作用的破壞，從而導致凝膠的網絡結構遭到破壞，凝膠發生流動。ZHANG等[7]的研究結果表明超分子水凝膠表現出類似非牛頓流體的剪切變稀的性質。

為了進一步研究本課題所制備的超分子水凝膠對藥物的緩釋作用，我們選擇了抗癌藥物PTX。圖9A所示，α-CD的濃度會對藥物的釋放速率產生極大的影響。由于C6水凝膠的強度比C4和C5水凝膠小，導致了C6水凝膠對PTX的釋放要比C4和C5更快。由于C6水凝膠對PTX的釋放集中在前24 h，因此我們推測水凝膠的凝膠降解（溶蝕）是其主要的釋放機理。同理，由于C4和C5水凝膠的強度較大，因此藥物的釋放過程可以持續72 h。因此，我們推測C4和C5水凝膠對藥物的釋放是擴散與凝膠降解（溶蝕）共同作用的結果。這些實驗結果表明，其藥物釋放的行為可通過α-CD的濃度來調控。

作為通用的抗癌藥物，PTX具有抑制腫瘤細胞并促進腫瘤細胞凋亡的作用，因此可通過研究超分子水凝膠對A549肺癌細胞的抑制效果來評價其藥效。圖9B所示為本研究所制備的負載PTX超分子水凝膠對A549肺癌細胞的抑制效果。結果顯示，負載PTX超分子水凝膠與PTX膠束具有同等的抗腫瘤效果，且抗腫瘤活性要優于游離的PTX。相類似的實驗結果也在ZHU等[13]的研究中得到佐證，其研究結果表明，超分子水凝膠對順鉑的釋放是一個持續性的過程。

綜上所述，本研究制備了負載抗腫瘤藥物PTX的可注射超分子水凝膠。XRD實驗表明，該超分子水凝膠主要是通過MPEG5000-PCL5000的MPEG部分與α-CD的主客體相互作用。因此，可以通過處方組分濃度的改變，調整凝膠化時間、凝膠強度、流變性質等參數，制備個性化的載藥超分子水凝膠。

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