富血小板纖維蛋白聯合自體骨髓濃縮物修復骨缺損的早期療效

楊穎，劉國，劉傳通，金瓊，朱飛

（溫州醫科大學 口腔醫學院，浙江 溫州 325027）

目前，臨床中用于解決頜面部缺損骨重建的方法是使用自體骨、同種異體骨或異種骨等骨替代物誘導新骨生成，但這幾種材料有其各自的不足。如作為骨替代材料“金標準”的自體骨在數量及大小上常不能滿足缺骨區的要求，還會增加骨供區的病理損害[1]，而同種異體骨和異種骨成骨作用較弱[2-3]，有再吸收及病毒傳播的風險[4]，因此有必要尋求一種更好的方法來解決骨量不足的問題。

富血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin，PRF）是第二代血小板濃縮物，富含血小板及各種細胞因子，具有促進組織愈合的能力，同時還含有抗炎因子和修復介質，具有調節炎癥反應和抗感染的能力。自體骨髓濃縮物（bone marrow aspirate concentrate，BMAC）是通過對骨髓抽吸物離心、分離后獲得的有核細胞的濃縮物，其內富含骨髓間充質干細胞（bone marrow stem cell，BMSC）、造血干細胞和淋巴細胞，被譽為骨替代材料的“鉑金標準”[5]。本研究將PRF與BMAC聯合應用于兔顱骨缺損，觀察其成骨能力，為其在臨床中的應用提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 12～16月齡健康日本大耳白兔6只，體質量1.5～2.0 kg，雌雄不限，由溫州醫科大學實驗動物中心提供并飼養，動物使用許可證號：SYXK（浙）2014-0006。

1.2 實驗方法

1.2.1 PRF的制備：采用CHOUKROUN等[6]提出的方法：兔心臟取血5 mL，放入不添加抗凝劑的離心管中，3 000 r/min的速度離心10 min。血液樣本分為3層（見圖1），中間層為乳白色的纖維蛋白凝膠（即PRF），上層和下層分別是貧血小板血漿層和紅細胞碎片層，取中間層，無菌紗布擠壓后剪成約1 mm×1 mm大小備用，另取一份壓成膜片行組織學分析。

圖1 PRF的制取

1.2.2 BMAC的制備：以含有0.2 mL肝素鈉（100 mg/L）的5 mL注射器，于兔雙側股骨處使用16號骨髓穿刺針各抽取骨髓2.5 mL，3 000 r/min離心10 min，可見骨髓分為3層（見圖2），上層為淡黃色漿液層，中間為黃褐色有核細胞層，下層為深紅色細胞層，用注射器抽取中間層（約1 mL）與PRF混合備用。

圖2 BMAC的制取

1.2.3 動物模型制備：實驗動物稱重，3%戊巴比妥鈉注射液按1 mL/kg劑量耳緣靜脈麻醉適度后，顱頂備皮。2%鹽酸利多卡因局部麻醉下于顱頂正中縱行切開皮膚并逐層分離，暴露顱中縫。0.9%氯化鈉溶液沖洗冷卻下使用環鋸于顱中縫兩側各制備2個直徑為5 mm的圓形骨缺損，隨機植入空白（A組）、自體骨沫（B組）、PRF+BMAC混合物（C組，見圖3），鈦膜覆蓋固定，分層縫合，10 d后拆線，術后肌注慶大霉素注射液1周（8×104U/d）。

圖3 骨缺損模型制備及骨移植材料填入

1.3 觀測指標 術后6周處死實驗兔，取顱骨標本行影像學觀察。PRF制做冰凍切片，HE染色，行組織學評價。計算骨缺損區的新骨生成率：取經過圓形骨缺損中心點的組織學切片進行觀測，以骨缺損邊緣為外邊界，顱骨外板為上邊界，顱骨內板為下邊界，40倍光鏡下，使用Image-Pro Plus 6.0軟件測量該區域的總面積以及該區域內新生骨面積，各測量3次，取平均值，計算骨缺損區的新骨生成率。

1.4 統計學處理方法 使用SPSS17.0軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大體觀察 實驗動物無一例死亡，術后2 d實驗兔飲食及生活習性恢復正常，骨缺損區域均無感染，創口愈合良好，鈦膜無移位。

2.2 影像學觀察結果 A組：骨缺損區基本無變化，骨缺損邊緣可見散在不透射影。B組：可觀察到骨缺損形狀，骨缺損自邊緣至中央可見大量低灰度不透射影。C組：骨缺損邊緣及中央均為低灰度不透射影像，彼此連接成橋狀，尤其是邊緣與周圍基骨已無明顯區別。見圖4。

2.3 組織學觀察結果

2.3.1 PRF評價結果：PRF為乳白色膠凍樣團塊，具有一定的彈性和韌性。光鏡觀察PRF膜片上端為染色均一的網狀纖維蛋白結構，呈條索狀，疏松多孔，未見任何細胞；下端可觀察到少量細胞核藍染的白細胞鑲嵌在纖維蛋白網內。見圖5。

圖4 影像學觀察結果

圖5 PRF膜片組織學觀察（HE染色）

2.3.2 骨缺損區組織學結果：6周時組織學切片示：A組骨缺損區以纖維結締組織為主，骨缺損邊緣可見少量成骨細胞和新骨生成。B組骨缺損區內可見大量不規則形狀的自體骨顆粒，并以自體骨顆粒為中心有新骨形成。與A組相比，骨缺損邊緣新生骨量更多，骨質更致密。C組骨缺損區可見大量新生骨，骨小梁排列規則緊密，且礦化程度較高，成骨細胞數量較A組和B組多，新生骨組織不僅局限于骨缺損邊緣，骨缺損中央也有大量新骨生成。見圖6。

2.3.3 統計學處理結果：6周時A組新骨生成率為（7.64±1.02）%，B組為（12.94±0.81）%，C組為（37.19±1.26）%，C組與A、B組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

PRF于2000年被成功制取并應用于口腔頜面部組織再生治療，其制備過程簡單易行，完全取自自體，且不添加抗凝劑及促凝劑，避免了交叉感染的風險，使用安全。有學者[7]提出，獲取PRF的技術關鍵在于血液的收集速度和放入離心機的速度。而兔模型因其動靜脈血管細小，很難快速收集到足夠的血液，本研究摒棄常規耳緣靜脈取血的方法，采用心臟取血的方法，證實能夠快速獲取足量的血液并成功制取PRF。也有學者對PRF的生物學特性進行了鑒定[8-10]，結果證明PRF的主體結構為纖維蛋白構成的三維網狀結構，內含血小板、各種生長因子及少量免疫細胞。本研究將成功制取的PRF制作冰凍組織學切片，證實了PRF的三維網狀纖維蛋白結構及含有少量白細胞的事實，但白細胞僅存于PRF層與紅細胞碎片層交界處，因此應在制取PRF時將交界處組織一并取出。

圖6 術后6周組織學觀察（HE染色）

自體骨髓含有促進骨再生的干細胞和骨祖細胞[11-13]，且其促進骨組織再生的能力與骨髓細胞的濃度成正相關[14]。BMAC是將自體骨髓通過離心、分離后獲得的有核細胞的濃縮物，與人工培養增殖的BMAC相比避免了污染的風險，且未培養的骨髓來源的細胞在骨組織再生中也表現出了更大的優勢[15-17]。在筆者之前的研究中，采用離心后人工分離制取BMAC的方法可獲得的細胞濃縮倍數為2～3倍，且細胞培養結果表明BMAC內的細胞具有干細胞的特性[18]，本研究采用該方法可成功獲取BMAC。

在以往的研究中，單獨應用PRF促進骨組織再生的效果有一定的局限，聯合其他骨替代材料往往可以獲得較理想的骨再生效果。OLIVEIRA等[19]將PRF單獨或聯合Bio-oss骨粉用于修復大鼠顱骨缺損，結果表明30 d時PRF聯合Bio-oss組獲得了遠高于其他組的新骨生成率。然而，骨替代材料的添加同時也增加了免疫及病毒傳播的風險，本研究將PRF復合BMAC用于修復兔顱骨缺損，新骨生成率遠大于自體骨組及空白對照組。該結論與WU等[20]的研究結果基本一致。PRF獨特的三維網格狀纖維蛋白結構能將骨髓干細胞網絡其中，并引導其遷移[21]；同時PRF較大的孔隙和良好的彈性，能夠促使營養成分及氧氣彌散至細胞周圍，促進干細胞的增殖分化，加速成骨過程[22]。

綜上，本研究探討了PRF聯合BMAC修復骨缺損的方法，二者能共同發揮作用，有效促進骨缺損的早期愈合，為臨床中自體骨移植量不足或不能接受同種異體骨及異種骨移植的患者提供了新的選擇。

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