M-CSF血清水平與慢性HBV感染患者肝臟纖維化程度的相關性研究

王殷秋，曹雯君，郜玉峰，馬雙雙，葉 珺，鄒桂舟，沈玉先

持續的炎癥反應被認為是慢性肝病發展成為肝纖維化的重要因素[1]。巨噬細胞作為肝臟炎癥的主要效應細胞，在炎癥中發揮炎性細胞調節、募集和激活肝星狀細胞的作用[2]。巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor, M-CSF)主要由活化的巨噬細胞，子宮內膜上皮分泌細胞，激活的成骨細胞等細胞產生[3-6]，是調節單核-巨噬細胞系細胞分化、增殖與生長的主要細胞因子[7]。早期研究[8]顯示，M-CSF的血清水平與急慢性肝病及肝硬化關系密切，且與轉氨酶水平相關。進一步研究發現，M-CSF能通過巨噬細胞介導的炎癥、免疫反應參與肝纖維化的病變過程[9]。

慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是我國慢性肝病患者發生肝臟纖維化的重要因素之一。慢性肝病患者肝臟纖維化程度的診斷尤為重要，若能早期做出準確診斷，并積極干預，可以逆轉纖維化進展。該文探討M-CSF在不同程度肝纖維化的慢性HBV感染患者血清中表達水平差異，并分析其與其他采用臨床指標之間的相關性，比較其與經典血清學無創診斷模型及瞬時彈性成像檢測肝纖維化的價值差異，有助于進一步闡明肝纖維化的發病機制。

1 材料與方法

1.1病例資料選取2014年1月～2016年3月就診于安徽醫科大學第二附屬醫院肝病科的175例慢性HBV感染患者為研究對象，所有患者診斷符合中國慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)的診斷標準。入組患者年齡16～67(39.10±11.45)歲；男女比例為2.80(129/46)；入組患者條件需符合：① HBV慢性感染病史>6個月，肝穿檢查前3個月以上未接受護肝治療及抗病毒治療；② 排除合并酒精性肝病、自身免疫性肝病、脂肪肝、其他嗜肝病毒感染或其他原因引起的肝功能異常；③ 排除合并嚴重其他系統疾病，如心血管疾病、風濕免疫系統疾病、代謝性疾病等；④ 排除合并梅毒感染及HIV感染。同時選取19例健康體檢者作為對照；所有入組的研究對象均簽署知情同意書。

1.2檢測方法

1.2.1M-CSF血清水平檢測 采集HBV感染者及健康體檢者空腹外周血,分離血清保存在-80 ℃冰箱，避免反復凍融。采用美國R&D sistems公司的Human M-CSF ELISA檢測試劑盒進行樣本檢測。

1.2.2其他臨床指標及病毒學指標檢測 乙肝五項定量采用雅培化學發光法檢測，HBV DNA采用實時熒光定量PCR檢測，采用美國Beckman公司全自動生化分析儀及其試劑分別檢測肝功能，谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase,ALT)(正常范圍：9～50 U/L)、谷草轉氨酶(aspartate transaminase,AST)(正常范圍：15～40 U/L)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)(正常范圍：35～135 U/L)、谷氨酰轉肽酶(glutamyl transpeptidase,GGT)(正常范圍：7～45 U/L)、白蛋白(albumin,ALB)(正常范圍：45～55 g/L)、球蛋白(正常范圍：20～40 g/L)。采用美國Beckman LH750 血球分析儀進行血小板(platelet, PLT)檢測(正常值范圍 100×109/L～300×109/L)。

1.2.3肝臟活組織檢查及病理診斷 超聲引導下行1 s快速穿刺活檢術穿刺獲取患者長度1.5～2.0 cm的肝臟組織，將標本固定于甲醛中，后進行石蠟包埋、連續切片，經HE染色及網狀纖維或Masson三色染色后于光學顯微鏡下觀察，由兩名病理醫師閱片診斷。根據《2000年病毒學肝炎防治方案》標準進行肝臟炎癥活動度分級(G0～G4)及纖維化分期診斷(S0～S4)。

1.2.4瞬時彈性成像檢測及多參數無創診斷模型計算 所有患者肝穿前使用Fibrotouch瞬時彈性成像檢測儀獲取肝臟硬度測量值(liver stiffness measurement，LSM)。APRI評分計算方法：APRI=[(AST/ULN×100)/PLT(109/L],其中ULN為ASL正常參考值上限。FIB-4指數計算公式為：FIB-4=(年齡×AST)/[PLT×(ALT的平方根)]。

2 結果

2.1M-CSF在不同纖維化和炎癥程度的慢性HBV患者的血清中的表達比較15例S0期患者、56例S1期患者、37例S2期患者、40例S3期患者、26例S4期患者以及19例健康者的M-CSF血清水平,顯示健康者與S0期患者之間、S1期與S2期患者之間、S3與S4期患者之間的M-CSF血清水平差異無統計學意義。因此，將患者分為無肝纖維化組(S0期及健康對照組)、輕中度肝纖維化組(S1-S2期)、重度肝纖維化組(S3-S4期)，各組之間M-CSF血清水平之間差異有統計學意義(P=0.000 2)。按照肝臟炎癥G分級，將入組患者分為5組，分別為無炎癥組(G0及正常對照組)、匯管區炎癥組(G1)、輕度碎屑壞死(piecemeal necrosis,PN)組(G2)、中度PN組(G3)和重度PN組(G4)，M-CSF的血清水平在各組之間差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 不同肝臟纖維化及炎癥程度的慢性HBV感染者M-CSF血清表達水平比較

2.2M-CSF血清水平與HBV病毒學指標之間關系將175例肝纖維化患者按照HBV DNA定量檢測結果分為2組，HBV DNA>2 000 IU/ml組(n=146)和HBV DNA<2 000 IU/ml(n=29),兩組患者M-CSF血清水平范圍分別在62.03～1 710.08 pg/ml和60.33～1 035.41 pg/ml。兩組之間M-CSF血清水平差異有統計學意義(P=0.005)。將入組所有患者分為HBeAg陽性組(n=66，M-CSF血清水平范圍為97.93～1 101.79 pg/ml)與HBeAg陰性組(n=109，M-CSF血清水平范圍為60.33～1 710.08 pg/ml)，兩組之間患者M-CSF血清水平差異無統計學意義。見圖2。

圖2 M-CSF血清水平在不同病毒學分組之間的差異比較

2.3M-CSF血清水平與肝功能指標之間的關系175例患者M-CSF血清水平與ALT、AST、ALP、GGT、ALB和球蛋白等肝功能指標之間的相關性分析顯示：M-CSF的血清水平與AST、ALP和GGT之間呈顯著正相關性(rs=0.169、0.167、0.151，P<0.05)，與ALB之間呈顯著負相關性(rs=-0.234，P=0.002)。而M-CSF的血清水平與其他肝功能指標之間無顯著相關性。各相關指標的統計描述見表1。

表1 M-CSF及其他指標的統計描述

2.4M-CSF的無創診斷肝纖維化價值分析根據M-CSF血清水平、APRI指數、FIB-4指數及LSM診斷≥S1期(發生纖維化)患者的ROC曲線分析出AUC值及其95%CI、P值、靈敏度、特異性，數據詳見表2；同時比較四種診斷指標的AUC顯示， M-CSF血清水平與FIB-4指數、LSM對≥S1期(存在纖維化)患者診斷的AUC之間差異有統計學意義(P=0.002、0.006)；而M-CSF與APRI二者的診斷效果差異無統計學意義。見圖3A。

M-CSF血清水平、APRI指數、FIB-4指數及LSM診斷S4期(早期肝硬化)患者的AUC值及95%CI、P值、靈敏度、特異性亦見于表2。四種檢測方法的AUC比較結果表明M-CSF血清水平與APRI、LSM之間差異有統計學意義(P=0.006 7、0.001 5)；而M-CSF與FIB-4指數的AUC之間差異無統計學意義。見圖3B。

表2 M-CSF及其他診斷模型診斷≥S1期及S4期的AUC分析

圖3 四種診斷指標預測纖維化的ROC曲線比較

3 討論

在中國慢性HBV感染是患者發生肝纖維化的重要病因之一。由于慢性乙型肝炎的長期遷延不愈，導致肝臟組織細胞持續損傷，炎性單核細胞在肝臟趨化聚集，分化成促纖維化的巨噬細胞，也同時激活肝臟固有的枯否氏細胞以及肝星狀細胞，最終誘導大量的細胞外基質產生，并擾亂其產生與降解之間的平衡，最終在肝內大量沉積[10]。M-CSF這一調節單核巨噬細胞系細胞分化增殖生長的重要調節因子，作為促炎性細胞因子參與了眾多炎癥相關性疾病的發生發展，肝纖維化也不例外[9]。

本研究通過對19例健康志愿者及175例不同纖維化分期的慢性乙型肝炎患者的M-CSF血清表達水平分析結果表明，炎癥分級越高的患者通常M-CSF血清水平越高；患者M-CSF的血清水平與AST、AKP和GGT水平呈顯著正相關性，與ALB呈顯著負相關性，這些都證實了M-CSF的血清水平與傳統的檢測肝功能的指標一樣，可以反映患者肝臟細胞、組織的損傷及肝臟功能[8]。本研究將入組的所有患者按照HBV DNA分為2組，觀察患者體內HBV的復制與血清M-CSF水平之間的相關性，結果顯示HBV DNA>2 000 IU/ml組患者的M-CSF血清水平高于HBV DNA<2 000 IU/ml組患者。這說明乙肝病毒復制活躍的患者具有相對較高水平的M-CSF，這可能是由于病毒復制活躍加速了肝臟損傷和炎癥反應，活化的星狀細胞以及損傷的肝細胞產生大量的M-CSF[9]。至于M-CSF是否可以通過調節單核巨噬細胞的功能從而促進病毒的復制，有待于進一步研究。

M-CSF在纖維化早期能夠提高單核細胞趨化因子CCL2、CCL4及其受體的表達水平，使肝外單核細胞募集進入肝臟病變區域，促進炎癥反應的持續[11-12]。在纖維化發展的后期，M-CSF還可以促進巨噬細胞的極化為M2型，促進HSC的過度激活，促進纖維化的進展和腫瘤的發生[9,13]。那么，M-CSF作為促纖維化的細胞因子，是否可以作為診斷肝纖維化分期的血清學指標，這一點有待證實。本研究顯示，M-CSF血清濃度在無肝纖維化、輕中度纖維化及重度纖維化三組患者之間具有顯著差異；通過對其診斷≥S1期(發生肝纖維化)的ROC曲線分析顯示其AUC為0.827，敏感度和特異性分別為74.4和80.0，這表明M-CSF對于慢性乙肝患者是否已經發生肝臟纖維化病變具有一定的診斷意義。對比其他診斷指標顯示，在對≥S1期肝纖維化的診斷有意義的基礎上，認為M-CSF的診斷價值優于LSM；而M-CSF與APRI二者對疾病診斷效能無顯著差異。

通過對M-CSF預測S4期(早期肝硬化)的ROC曲線的分析顯示，其AUC為0.627，敏感度為59.7，特異性為73.0，由此可見M-CSF對早期肝硬化的診斷效果較其他指標稍差。通過與其他診斷指標的ROC曲線對比分析表明，APRI指數及LSM對早期肝硬化的診斷價值優于M-CSF。M-CSF對早期肝硬化(S4期)的診斷效能稍差，目前暫考慮與入組的樣本量較少有關；或者可以通過聯合其他和M-CSF相關的指標聯合診斷來提高其診斷效能。

現普遍認為，單核巨噬細胞是除HSC外在肝臟纖維化病變發展中最為重要的細胞。M-CSF主要是通過各種不同途徑調節單核巨噬細胞功能來促進纖維化的進展。而在對肝癌及癌旁組織的研究[14-15]中顯示，M-CSF及其受體在肝癌周圍組織中的表達與患者發生腫瘤肝內轉移以及行肝癌切除術后的不良預后相關，推測M-CSF以及受體可能是一個潛在的藥物靶點。那么M-CSF是否也可以成為調控肝纖維化的靶點，為新藥的開發提供新的方向，值得進一步探討。

參考文獻

[1] Schuppan D, Afdhal N H. Liver cirrhosis[J]. Lancet, 2008,371(9615):838-51.

[2] 吳俊烯,劉耕陶.Kupffer細胞在肝纖維化形成與轉歸中的作用[J].藥學學報,2008,43(9):884-9.

[3] 祝 捷,董崇周,胡圓圓,等.RANKL聯合M-CSF體外誘導人外周血單個核細胞成為破骨樣細胞的研究[J].安徽醫科大學學報, 2010,45(5):618-20.

[4] Chitu V, Stanley E R. Colony-stimulating factor-1 in immunity and inflammation[J] Curr Opin Immunol, 2006,18(1):39-48.

[5] Gow D J, Sester D P, Hume D A. CSF-1, IGF-1, and the control of postnatal growth and development[J]. J Leukoc Biol,2010, 88(3):475-81.

[6] Hamilton J A.Colony-stimulating factors in inflammation and autoimmunity[J]. Nat Rev Immunol,2008,8(7):533-44.

[7] Douglass T G,Driggers L,Zhang J G,et al.Macrophage colony stimulating factor: not just for macrophages anymore! A gateway into complex biologies [J].Int. Immunopharmacol, 2008, 8(10):1354-76.

[8] Itoh Y,Okanoue T, Enjyo F,et al. Serum level of macrophage colony stimulating factor(M-CSF) in liver disease[J].J Hepatol,1994,21(4):527-35.

[9] Preisser L, Miot C, Le Guillou-Guillemette H, et al. IL-34 and macrophage colony-stimulating factor are overexpressed in hepatitis C virus fibrosis and induce profibrotic macrophages that promote collagen synthesis by hepatic stellate cells.[J].Hepatology,2014,60(6):1879-90.

[10] 張 偉,賈繼東.肝纖維化的發病機制及治療新靶點[J].臨床肝膽病雜志,2017,33(3):409-12.

[11] Tacke F.Functional role of intrahepatic monocyte subsets for the progression of liver in flammation and liver fibrosisinvivo[J].Fibrogenesis Tissue Repair,2012,5(Suppl 1):S27.

[12] Ehling J,Bartneck M,Wei X,et al.CCL2-dependent infiltrating macrophages promote angiogenesis in progressive liver fibrosis[J].Gut,2014,63(12):1960-71.

[13] 田小霞,張慧英,陳云霞,等.巨噬細胞極化在大鼠肝硬化發生發展中的作用[J]. 中國病理生理雜志,2016,32(5):880-5.

[14] Zhu X D,Zhang J B,Zhuang P Y,et al.High expression of macrophage colony-stimulating factor in peritumoral liver tissue is associated with poor survival after curative resection of hepatocellular carcinoma[J].J Clin Oncol,2008,26(16):2707-16.

[15] Jia J B,Wang W Q,Sun H C,et al.High expression of macrophage colony-stimulating factor-1 receptor in peritumoral liver tissue is associated with poor outcome in hepatocellular carcinoma after curative resection[J].Oncologist,2010,15(7):732-43.