甘氨酸對脂多糖刺激引起的斷奶仔豬腸道能量代謝紊亂的影響

余 程， 王秀英， 吳歡聽， 張 琳， 劉玉蘭， 汪文俊*

（1.中南民族大學生命科學學院，湖北武漢430074；2.武漢輕工大學動物營養與飼料科學湖北省重點實驗室，湖北武漢430023）

腸道是重要的消化、吸收器官，也是機體重要的免疫器官，在免疫應激中最易受損（李爽，2013）。脂多糖（LPS）可刺激免疫系統，造成免疫應激（劉玉蘭等，2008）。研究發現，LPS刺激可造成胃腸道蠕動減慢，腸黏膜缺血和缺氧（劉堅等，2009）。此外，LPS刺激可導致機體釋放過量的炎性細胞因子，產生大量的自由基，造成脂質過氧化反應，而這些變化會破壞線粒體結構完整性和細胞色素氧化酶系統，阻礙呼吸鏈的電子傳遞，造成ATP合成障礙，使腸道能量代謝紊亂（李爽，2013；劉堅等，2009）。

甘氨酸（Gly）在傳統氨基酸分類上是一種非必需氨基酸，研究表明，日糧中添加Gly對機體的發育起著重要作用，是保證哺乳動物最大生長速率的條件性必需氨基酸（Wu等，2013）。仔豬日糧中添加Gly對提高采食量，增強機體抗氧化能力以及維持腸道完整性有重要意義（Wu等，2013）。Gly可抑制鈣蛋白酶的活性，保護細胞免受三磷酸腺苷（ATP）衰竭的影響（谷俊朝等，2005）。 另外，Gly分解后可生成乙酰輔酶A，進一步參與三羧酸（TCA）循環（王鏡巖等，2002）。目前關于Gly對腸道能量代謝影響的研究報道較少。本試驗通過給斷奶仔豬注射LPS建立腸道損傷模型（劉玉蘭等，2008），研究日糧中添加Gly對腸道能量代謝水平和LPS刺激導致腸道損傷的影響。

1 材料及方法

1.1 試驗材料 Gly和丙氨酸純度均大于99.5%，購自武漢阿米諾科技有限公司。LPS（大腸桿菌血清型055∶B5）購自Sigma公司，溶于生理鹽水，以100μg/kg BW劑量注射。

1.2 試驗動物與飼養管理 選擇24頭健康、體況相近 （7.17±0.41）kg的杜×長×大斷奶仔豬[（21±1）d 日齡斷奶]，根據體重相近的原則隨機分為4個處理組，每組6頭豬。飼養周期35 d，預試7 d待仔豬適應試驗日糧后，進行正式試驗。試驗前的驅蟲及消毒等程序根據豬場飼養管理規范進行。飼養過程中，仔豬可自由飲水采食。豬舍溫度維持25～27℃。

1.3 試驗飼糧和設計 參照NRC（1998）仔豬飼養標準配制基礎日糧，基礎日糧組成及營養水平見表1。在各組飼糧中添加丙氨酸以達到等氮。本試驗分為4個處理組，分別為對照組、LPS組、1.0%Gly組和2.0%Gly組。對照組和LPS組飼喂基礎日糧，后兩組飼喂分別添加了1.0%Gly和2.0%Gly的日糧。正式試驗第28天時，LPS組、1.0%Gly組和2.0%Gly組仔豬注射LPS，對照組注射相同劑量生理鹽水。

表1 基礎日糧組成及營養水平

1.4 腸道樣品采集與處理 注射LPS或生理鹽水4 h后，仔豬注射戊巴比妥鈉，待充分麻醉后進行屠宰，剖開腹腔取空腸和回腸樣品置于冰上。剖開小腸，用4℃生理鹽水沖洗腸段。待濾紙充分吸干水分后，用載玻片刮取空腸和回腸黏膜，分裝至離心管中，凍存待測。

1.5 檢測指標

1.5.1 腺苷酸含量的測定 腸道的樣品參照李爽（2013）的方法進行前處理，采用反向高效液相色譜系統測定樣品中ATP、二磷酸腺苷（ADP）和一磷酸腺苷（AMP）的濃度，標準品也在相同的色譜條件下測定。通過標準品對應的峰面積和濃度建立標準曲線方程，根據所測樣品的峰面積計算腸道三種腺苷酸（ATP、ADP和 AMP）含量，以 μg/g黏膜重表示。腺苷酸池（TAN）和能荷（EC）水平的計算參照下述公式（李爽，2013）：

TAN=ATP+ADP+AMP；

EC=（ATP+1/2ADP）/（ATP+ADP+AMP）。

1.5.2 TCA循環關鍵酶活性的測定 TCA循環關鍵酶包括檸檬酸合成酶（CS）、異檸檬酸脫氫酶（ICDH） 和 α-酮戊二酸脫氫酶復合體 （α-KGDHC），其酶含量的測定方法與李爽（2013）一致，采用ELISA法進行測定。

1.5.3 能量代謝相關因子mRNA表達量的測定測定的基因包括腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、沉默信息調節因子1（Sirt1）、過氧化物酶體增殖物受體-α 輔激活因子1α（PGC-1α）。組織總 RNA提取、cDNA合成、Real-time PCR參照李爽（2013）的方法。待測基因及內參基因GAPDH的引物見表2。所測基因的mRNA表達量采用2-ΔΔCT計算（Livak 和 Schmittgen，2001）。

表2 基因的引物序列

1.6 統計分析 試驗數據采用SPSS 22.0統計軟件進行單因素方差分析和LSD多重比較。統計結果用平均值和SEM表示。P≤0.05表示顯著差異，0.05＜P≤0.10表示具有差異顯著性趨勢。

2 結果與分析

2.1 Gly對LPS刺激仔豬腸道能量代謝指標的影響 由表3可知，與對照組相比，LPS刺激導致空腸ATP含量、TAN和EC水平分別下降44.5%、21.2%、19.4%，AMP/ATP比值升高96.1%，回腸ATP、ADP含量和 TAN水平降低21.9%、12.9%、18.0%（P ＜0.05）。 與 LPS組相比，1.0%Gly使空腸TAN水平提高14.9%（P=0.05），有升高空腸AMP含量的趨勢 （P＜0.10）；2.0%Gly有提高空腸ATP含量和EC水平的趨勢（P＜0.10）。

表3 Gly對LPS刺激仔腸道臟能量代謝指標的影響（以濕重為基礎）

2.2 Gly對LPS刺激仔豬腸道TCA循環關鍵酶活性的影響 由表4可知，與對照組相比，LPS刺激導致空腸 TCA循環關鍵酶 CS、ICDH和 α-KGDHC的活性分別降低15.0%、13.2%、23.2%，回腸TCA循環關鍵酶CS、ICDH和α-KGDHC的活性分別降低 24.3%、23.5%、51.8%（P＜0.05）。1.0%Gly有提高回腸α-KGDHC活性的趨勢（P＜0.10）；2.0%Gly使空腸 ICDH和回腸 α-KGDHC活性分別提高15.9%和41.3%（P＜0.05），同時有提高回腸CS活性的趨勢（P＜0.10）。

2.3 Gly對LPS刺激仔豬腸道能量代謝相關基因mRNA表達的影響 由表5可知，與對照組相比，LPS刺激導致空腸 PGC-1α、回腸 Sirt1和PGC-1α的mRNA表達量分別降低55.0%、18.0%、55.0%（P ＜ 0.05）。 與 LPS組相比，1.0%Gly使空腸 PGC-1α的mRNA表達水平提高64.4%（P ＜ 0.05）；2.0%Gly使空腸 PGC-1α、回腸Sirt1和PGC-1α的mRNA表達水平分別提高51.1%、22.0%、60.0%（P ＜ 0.05）。

表4 Gly對LPS刺激仔豬腸道TCA循環關鍵酶活性的影響（以蛋白質為基礎）

表5 Gly對LPS刺激仔豬腸道能量代謝相關基因mRNA表達的影響

3 討論

ATP是細胞的重要供能物質，細胞內ATP與ADP可相互轉換，進而維持ATP的動態平衡，持續地為細胞提供能量（王鏡巖等，2002）。另外，細胞中ATP、ADP和AMP含量的動態變化可調控細胞的代謝過程（王鏡巖等，2002）。TAN為三種腺苷酸之和，是描述細胞代謝和能量儲備狀態的重要參數（楊震國等，2012）。為了衡量細胞中高能磷酸鍵的多少，1968年Atkinson提出了EC的概念，EC可動態調節細胞的能量平衡（楊震國等，2012）。

本試驗中，LPS刺激導致腸道ATP和ADP含量、TAN和EC水平下降，AMP/ATP比值升高，表明LPS刺激阻礙了腸黏膜的能量代謝。劉堅等（2009）研究表明，LPS刺激后腸上皮細胞ATP分解代謝增強，加劇了腸道能量供應不足；Bradley（1979）發現LPS自身及其介導的腸道黏膜組織缺血缺氧和過氧化損傷會破壞線粒體膜結構的完整性，抑制氧化磷酸化相關酶如ATP合成酶和電子傳遞鏈中相關酶如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）脫氫酶的活性，進而減少ATP合成，導致機體能量代謝紊亂。本試驗結果顯示，日糧中添加Gly提高了空腸ATP和AMP含量、TAN和EC水平。Wu等（2013）發現飼糧中約30%的Gly在幼齡仔豬小腸的首過代謝中被降解產能。有研究表明，Gly可通過斯提柯蘭氏反應產生乙酸，給宿主特別是腸道上皮細胞提供能量（朱偉云等，2014）。因此，我們推測Gly可被機體利用產能，緩解LPS刺激導致的仔豬腸道能量不足。

TCA是需氧生物體重要的能量生成途徑，機體對ATP的需求決定了TCA循環的速率 （王鏡巖等，2002）。 CS、ICDH 和 α-KGDHC 是 TCA 循環中的三種關鍵限速酶，均存在真核細胞的線粒體中 （王鏡巖等，2002）。CS是TCA循環的第一個關鍵限速酶，可催化乙酰輔酶A生成檸檬酸，調控生物體的能量代謝 （史紅超和蘇鐵柱，2011）。ICDHs可依據輔酶分為 NAD-ICDH和NADP（酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸）-ICDH，催化異檸檬酸生成α-酮戊二酸 （史紅超和蘇鐵柱，2011）。α-KGDHC是TCA中一個關鍵調控位點，可催化α-酮戊二酸生成琥珀酰輔酶A（王鏡巖等，2002）。

本試驗中，LPS刺激導致TCA循環三種限速酶的活性下降，這與李爽（2013）的研究結果類似。本試驗結果顯示，Gly能顯著提高腸道TCA循環三種限速酶的活性，表明Gly能提高TCA循環的反應速率，使機體獲得更高的能量供給。有研究發現，LPS刺激產生的自由基可造成TCA循環酶的氧化損傷（Kowaltowski和 Vercesi，1999），而 Gly具有抗氧化能力，可清除腸道的自由基 （杜瑞平等，2015）。因此，我們猜測Gly可能通過清除LPS刺激產生的自由基，進而對TCA循環限速酶起保護作用，最終改善腸道的結構和功能。此外，Gly也可能在機體內分解生成乙酰輔酶A進而激活CS，促進TCA循環（史紅超和蘇鐵柱，2011；王鏡巖等，2002）。

AMPK是細胞能量變化的感受器，當機體缺乏能量或營養時，AMP/ATP比值上升，AMPK被磷酸化激活，進而調控相關信號通路使能量恢復至正常水平（王艷等，2013）。AMPK激活后可提高NAD+水平進而影響Sirt1的活性（王艷等，2013）。Sirt1屬于去乙酰化酶（Sirtuin）家族，可促進糖異生和脂代謝以及調控胰島β細胞分泌胰島素來增加機體ATP的含量 （趙靜姝和王蓉，2011）。Sirt1也可催化PGC-1α脫乙酰而使其激活（趙靜姝和王蓉，2011）。PGC-1α是一種與能量代謝密切相關的核轉錄輔激活因子，能通過增強細胞呼吸率和利用能量底物產生能量進而使細胞適應環境的改變（李博等，2011）。

本試驗中，LPS刺激顯著降低Sirt1和PGC-1α的mRNA表達量，這與Kang等（2015）的結果類似。本試驗結果顯示，Gly緩解了LPS刺激導致的Sirt1和PGC-1α的mRNA表達量的降低。Gly可能通過直接或者間接調節Sirt1和PGC-1α，從而提高機體產能。試驗中LPS刺激和Gly的添加對腸道AMPKα1和AMPKα2的mRNA表達量均無顯著影響。研究表明，細胞中ATP含量降低，上升的AMP達到一定水平，才能激活AMPK的活性（王艷等，2013；Wijesekara 等，2006），而本試驗中可能是因為仔豬腸道能量變化沒有達到AMPK的感受范圍，所以其表達量無顯著變化。

4 結論

本試驗結果表明，Gly可緩解LPS刺激導致的腸道能量代謝紊亂，降低TCA循環關鍵酶活性以及Sirt1和PGC-1α的mRNA表達量。

參考文獻

[1]杜瑞平，張興夫，高民，等.甘氨酸的免疫調節作用及其分子機制[J].動物營養學報，2015，27（3）：663 ～ 670.

[2]谷俊朝，馬濤，王宇.甘氨酸保護作用機制與相關疾病探討[J].北京醫學，2005，27（9）：560 ～ 563.

[3]李爽.天冬酰胺對脂多糖刺激斷奶仔豬腸道損傷的調控作用：[碩士學位論文][D].武漢:武漢輕工大學，2013.

[4]李博，田瑞霞，楊衛景，等.PGC-1α的功能與代謝病[J].中國生物化學與分子生物學報，2011，27（11）：1013 ～ 1018.

[5]劉玉蘭，魯晶，石君霞，等.豬免疫應激研究進展[J].畜牧與獸醫，2008，40（2）：99 ～ 102.

[6]劉堅，侯永清，丁斌鷹，等.α-酮戊二酸對脂多糖應激仔豬腸黏膜能量代謝的影響[J].動物營養學報，2009，21（6）：892 ～ 896.

[7]史紅超，蘇鐵柱.三羧酸循環及其影響因素對運動能力的影響[J].遼寧體育科技，2011，33（3）：45 ～ 47.

[8]王鏡巖，朱圣庚，徐長法.生物化學[M].北京:高等教育出版社，2002．

[9]王艷，黃德強，羅志軍.AMPK對線粒體功能的調節[J].中國細胞生物學學報，2013，35（10）：1434 ～ 1443.

[10]楊震國，張偉，侯永清，等.N-乙酰半胱氨酸對脂多糖刺激仔豬肌肉能量狀況的影響[J].中國畜牧獸醫文摘，2012，23（2）：615～621.

[11]趙靜姝，王蓉.SIRT1功能的研究進展[J].國際內分泌代謝雜志，2011，31（2）：110 ～ 112.

[12]朱偉云，余凱凡，慕春龍，等.豬的腸道微生物與宿主營養代謝[J].動物營養學報，2014，26（10）：3046 ～ 3051.

[13]Bradley S G.Cellular and molecular mechanisms of action of bacterial endotoxins[J].Annu Rev Microbiol，1979，33（33）：67 ～ 94.

[14]Kang P，Liu Y，Zhu H，et al.The effect of aspartate on the energy metabolism in the liver of weanling pigs challenged with lipopolysaccharide[J].Eur JNutr，2015，54（4）：1 ～ 8.

[15]Kowaltowski A J，Vercesi A E.Mitochondrial damage induced by conditionsof oxidative stress[J].Free RadicBiol Med，1999，26（3 ～4）：463 ～ 471.

[16]Livak K J，Schmittgen T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and 2-ΔΔCTmethod[J].Methods，2001，25（4）：402 ～ 408.

[17]Wijesekara N，Tung A，Thong F，et al.Muscle cell depolarization induces a gain in surface GLUT4 via reduced endocytosis independently of AMPK[J].Am J Physiol Endocrinol Metab，2006，290（6）：1276 ～ 1286.

[18]Wu G，Wu Z，Dai Z，et al.Dietary requirementsof"nutritionally non-essential amino acids"by animals and humans[J].Amino Acids.2013，44（4）：1107 ～ 1113.