131例神經系統疾病患者血清中抗BP180和抗BP230抗體的檢測

王亞如 李洪軍 許德志 王建文 周桂芝 楊寶琦

大皰性類天皰瘡(Bullous Pemphigoid，BP)是最常見的自身免疫性表皮下大皰病，多見于60歲以上的老年人，其發病率與年齡呈正相關[1,2]。BP180和BP230是BP的兩種抗原，已經明確抗BP180抗體具有致病性, NC16a為BP180外功能區的非膠原區，是致病性免疫球蛋白IgG自身抗體結合的主要靶位[3]。流行病學調查研究顯示，30%～50%的BP患者伴隨神經系統疾病(Neurological Diseases，ND)，包括認知障礙、腦卒中、癲癇、帕金森病和多發性硬化癥等，表明ND與BP之間存在一定關聯[4]。雖然少量研究發現BP確診后會增加ND的發病風險，但多數觀點認為患有ND會增加BP發生的風險[5]。既往研究表明BP與神經退行性疾病之間具有關聯性，BP抗原在中樞神經系統中有表達，因此有學者認為BP180和BP230可能為BP和ND的共同抗原[6,7]。為了驗證這一假設，本研究在ND患者中檢測BP自身抗體，旨在證實ND與BP發病之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例資料 本研究獲得山東省皮膚病醫院醫學倫理委員會的批準。收集ND住院患者以及體檢中心體檢者生化檢查后剩余血清，-80℃冰箱保存備用。病例入選標準：經過相關檢查，主治醫師及以上職稱醫師確診主要診斷為ND；對照入選標準：健康體檢者，排除ND、免疫相關性疾病、腫瘤、大皰性皮膚病、濕疹、多形紅斑、瘙癢病以及慢性蕁麻疹等。

1.1.2 主要試劑 歐蒙醫學實驗診斷股份公司(EUROIMMUN，德國)提供的抗BP180NC16a、抗BP230抗體IgG酶聯免疫吸附法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)檢測試劑盒；間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence,IIF)抗表皮棘細胞橋?？贵w/抗表皮基底膜抗體檢測試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 ELISA方法檢測抗BP180NC16a、抗BP230抗體 檢測依照試劑盒說明書進行，評判依據為歐蒙推薦的正常范圍上限(cut-off)20 RU/mL。認為濃度值≥20 RU/mL為陽性；濃度值<20 RU/mL為陰性。

1.2.2 IIF方法檢測抗表皮基底膜帶抗體 熒光顯微鏡下觀察，如果抗表皮基底膜抗體陽性，則在表皮基底層與結締組織間出現細線性熒光。

1.3 統計學方法 數據采用SPSS 22軟件分析。采用獨立樣本t檢驗及卡方檢驗進行統計學分析。

2 結果

2.1 病例組和對照組基本情況 共收集泰安市中心醫院、濟南市第五人民醫院、山東大學第二醫院神經內科和神經外科131例住院ND患者血清，其中男78例，女53例，年齡為19～89歲，平均(61.18±13)歲；樣本疾病類型為腦卒中109例(腦梗塞88例，腦出血19例，腦梗塞合并腦出血2例)、腦腫瘤15例、其他ND疾病7例包括癲癇、震顫、腦膿腫等。病程為0～7年，6例為首次發病，3例患者病程1年以下，1例患者病程3年，2例患者病程4年，3例患者病程分別為5年、6年、7年。收集到131例與之相匹配的正常對照血清，其中男78例，女53例，年齡為26～96歲，平均(58.98±12.82)歲，兩組間年齡無統計學差異(t=1.383，P=0.168)。

2.2 病例組和對照組抗BP180NC16a和抗BP230抗體陽性率比較 131例ND組中抗BP180NC16a抗體陽性15例，陽性率為11.45%；抗BP230抗體陽性7例，陽性率為5.34%?？笲P180NC16a和抗BP230抗體均為陽性者共2例，1例患者為腦梗死，1例患者為腦梗死并發顱內動脈瘤。

131例對照組中抗BP180NC16a抗體陽性4例，陽性率為3.05%；抗BP230抗體陽性3例，陽性率為2.29%。采用Pearson卡方檢驗對兩組數據分別進行統計學分析，兩組間抗BP180NC16a抗體陽性率差異有統計學意義(χ2=6.866，P=0.009)，但是兩組間抗BP230抗體陽性率差異無統計學意義(χ2=1.66，P=0.20)。見圖1。

2.3 ≥60歲病例組和對照組血清抗BP180NC16a、抗BP230抗體的陽性率比較 病例組和對照組中≥60歲者中，抗BP180NC16a抗體在ND組中陽性9例，對照組中陽性1例，陽性率為12.5%(9/72)、1.39%(1/72)；抗BP230抗體在ND組中陽性6例，對照組中陽性1例，陽性率分別為8.33%(6/72)、1.39%(1/72)。采用Pearson卡方檢驗對兩組數據分別進行統計學分析，兩組間抗BP180NC16a抗體陽性率差異有統計學意義(χ2=6.878，P=0.009)，抗BP230抗體陽性率差異無統計學意義(χ2=2.403，P=0.12)。見圖2。

2.4 <60歲病例組和對照組血清抗BP180NC16a、抗BP230抗體的陽性率比較 <60歲受試者中，抗BP180NC16a抗體在ND組中陽性6例，對照組中陽性3例，陽性率分別為10.17%(6/59)、5.08%(3/59)，采用連續性校正卡方檢驗，兩組之間陽性率差異無統計學差異(χ2=0.481，P=0.49)；抗BP230抗體在ND組中陽性1例，對照組中陽性2例，陽性率分別為1.69%(1/59)、3.39%(2/59)，采用連續性校正卡方檢驗，兩組之間陽性率差異無統計學差異(χ2=0，P=1)。見圖3。

2.5 病例組中≥60歲和<60歲抗BP180NC16a、抗BP230抗體的陽性率比較 把病例組分為≥60歲和<60歲組， ≥60歲組中抗BP180NC16a抗體陽性9例，抗BP230抗體陽性6例，陽性率分別為12.5%(9/72)、8.33%(6/72)；<60歲組中抗BP180NC16a抗體陽性6例，抗BP230抗體陽性1例，陽性率分別為10.17%(6/59)、1.69%(1/59)。將兩組間進行卡方檢驗，P值分別為0.68、0.20，均>0.05,差異均無統計學意義。

2.6 IIF檢測病例組和對照組血清中的抗基底膜帶抗體的情況 ND組和對照組均未在表皮基底層與結締組織間出現線性熒光，也無表皮細胞間熒光沉積，抗基底膜帶抗體均為陰性。

圖1 ND組與對照組抗體陽性分布圖

圖2 ≥60歲ND組與≥60歲對照組抗體陽性分布圖

圖3 <60歲ND組與<60歲對照組抗體陽性分布圖

3 討論

BP在中歐與北美以每10萬居民每年新增0.25～4.28例，且每10年內以2～4倍的速度在增長，典型的皮損表現為明顯瘙癢及緊張性大皰[8，9]。BP抗原位于表皮-真皮交界處，基底細胞通過半橋粒固定在基底膜帶上建立表皮與真皮之間的連接。從分子水平看，BP的自身抗原為兩種半橋粒成分：BP180(BPAg2或XVII膠原)和 BP230(BPAg1)，二者均具有生物活性，既表達于皮膚中，也在腦組織中表達[6]。有假設提出BP自身抗原與中樞神經系統疾病相關，Sepp?nen等人在尸檢樣品檢測中證實，BP180存在于人類腦神經元中，推測神經系統發生退行性變和炎癥后BP180可以觸發自身免疫啟動，導致ND患者中抗BP抗體產生[7，10]。

BP診斷根據典型臨床表現、病灶周圍活檢及直接免疫熒光檢查(DIF)示線狀IgG和C3在基底膜帶沉積。3/4的BP患者在IIF檢查中有針對表皮基底膜的循環IgG自身抗體在基底膜帶沉積[11]。在過去的幾年中， ELISA的高敏感性和特異性試驗已用于BP患者抗體的檢測，成為臨床常規評估的一部分[12]。因此本研究用ELISA及IIF法檢測ND患者血清樣品是否有抗BP180、抗BP230、抗基底膜帶抗體的存在。

BP自身抗原與中樞神經系統相關的假設同樣被本研究結果所支持，抗BP180NC16a抗體在ND患者中的陽性率為11.45%，明顯高于同年齡段的正常人。但是在本研究中，抗BP230抗體在ND患者與正常人中無明顯差異。既往研究發現抗BP180抗體與臨床BP的發生相關性更高，因為BP180胞外域NC16a區域識別IgG是BP的發病關鍵和早期改變，隨后是抗BP230抗體的表位擴散[13]。本研究數據也表明，與ND相關的自身免疫反應抗體是抗BP180NC16a抗體，而不是抗BP230抗體。

多數研究都表明BP在老年人中具有較高的發病率[14]，抗BP180抗體在非BP人群中的研究發現，抗體的發生率并不因性別或年齡變化而明顯增加[15]。本研究中： ≥60歲ND組和<60歲ND組的抗BP180抗體陽性率分別為12.5%和10.17%，P=0.68；表明ND組不同年齡組間抗體水平無差異。但是抗BP180NC16a抗體在≥60歲的ND組與同年齡對照組中存在明顯差異(p<0.01)，而在<60歲的兩組中，ND組抗BP180抗體陽性率雖高于對照組，但統計學無差異，所以我們認為，相對于年齡，ND對抗BP180抗體影響更大，但可能由于樣本量較少或其他混合因素(如合并其他老年性疾病或服用藥物等)，導致其在<60歲的ND兩組中不具有統計學差異。年齡與ND和BP的相關性仍然需要進一步研究。

臨床常使用IIF作為檢測BP抗基底膜帶抗體的方法，其敏感性為75%～96%[17，18]。然而，結合臨床特點、病理分析和IIF，才能更好的確診BP。本研究中，使用IIF檢測病例組和對照組血清抗基底膜帶抗體，結果均為陰性。這一結果同Kokkonen等[19]的研究結果相同，他們報道了18例阿爾茲海默癥患者血清中抗BP180抗體陽性但是抗基底膜帶抗體結果全部為陰性。

本研究結果表明，ND患者的自身抗體譜與BP患者體內的抗體不一致，或許ND代表一個BP患者發病前的亞群。這些患者可能先有神經免疫反應，后來由于其他因素發展成為皮膚免疫反應。在本研究中ND組和對照組共19例檢測者出現陽性ELISA結果，迄今為止沒有1例有發展成BP的臨床證據，將來是否發展為BP仍需要隨訪。

總之，本研究發現抗BP180NC16a抗體在神經系統疾病患者中有較高的陽性率，推測神經炎癥或神經退行性疾病的發生發展可能導致血腦屏障功能減弱及腦免疫赦免的缺失,使存在于神經組織中的BP180及BP230亞型暴露，經由“分子間表位擴散”，使神經和皮膚的抗原之間發生“免疫交叉”反應，形成針對皮膚的抗原亞型，產生皮膚BP癥狀[10]。這可能與ND患者合并BP有關，也可解釋為何BP患者常出現在神經系統損害之后。

本研究檢測ND患者血清中BP抗體的情況，未區分ND疾病種類，也未對陽性患者抗體滴度的動態變化及后續結局進行監測，如有條件，應擴大各組樣本后進行各疾病之間的比較統計，并對研究人群(特別是陽性樣本)進行前瞻性研究和長期隨訪，有助于更好的了解BP發生發展過程以及與ND之間的聯系。

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