大鼠腦缺血再灌注后線粒體ATP酶活性、形態學變化及丹參多酚酸的保護作用

李富強， 王 偉， 尹金鵬， 馮 濤， 尹曉剛， 鄧 倩， 劉榮志， 白宏英

線粒體功能障礙在缺血性腦損傷中起著重要作用。近年來研究發現線粒體功能障礙與線粒體ATP酶密切相關。線粒體ATP酶是一種存在于線粒體膜依靠ATP能量蛋白酶，主要有Na+/K+ATP酶、Ca2+ATP酶、Mg2+ATP酶組成；依靠ATP能量逆梯度轉運線粒體內Na+、Ca2+，維持線粒體鈣平衡。腦缺血再灌注損傷后，線粒體功能衰竭，ATP合成障礙，線粒體ATP酶活性下降，引起線粒體內鈣超載，最終引起細胞凋亡[1]。丹參屬于唇齒科植物，其根莖有活血、養血、通心絡作用，已經廣泛應用心血管疾病、腦血管疾病、白血病等[2]。注射用丹參多酚酸(Salvianolate)是從中藥丹參中提取的水溶成分，其主要成分是丹酚酸B，研究證明其可以通過提高血管內皮生長因子，白細胞介素-10表達，減低大鼠神經行為學評分起到腦保護作用[3]。但其對線粒體的保護作用研究較少，本研究通過大鼠缺血再灌注模型探討注射用丹參多酚酸的腦保護作用是否與線粒體ATP酶相關，為明確保護機制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與模型制備 健康雄性SD大鼠，體重(300±20)g，由鄭州大學動物實驗中心提供。將54只雄性SD大鼠隨機分成3組(n=18)：假手術組、注射用丹參多酚酸組、缺血再灌注組。模型制備：采用改良Zea Longa法制備大鼠右側中動脈缺血再灌注模型。假手術組手術過程中，分離右側頸總、頸內、頸外動脈但不插入線栓。注射用丹參多酚酸組、缺血再灌注組線栓待缺血2 h后，緩慢抽出線栓再灌注24 h。動物蘇醒后出現右側Horner征、眼裂變小、瞳孔縮小和左側軀體運動障礙評定為模型成功。丹參多酚酸組于缺血2 h再灌注24 h后連續7 d給予10 mg/kg尾靜脈注射，每天1次。假手術組、缺血再灌注組給予等量生理鹽水尾靜脈注射。末次給藥6 h后功能評分后取腦。

1.1.2 主要試劑與儀器 注射用丹參多酚酸(天津天士力之驕藥業有限公司，國藥準字Z20110011)，顯微手術器械(上海手術器械廠)；氯化三苯基四氮唑(TTC，批號：030227，北京化學試劑公司)；低溫高速離心機(德國，Kendro Labrotary)；石蠟切片機、倒置顯微鏡(德國Leica公司)；丙二醛試劑盒及ATP酶試劑盒(南京建成科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 腦梗死體積測定 大鼠腦組織應用冰箱-20 ℃冷凍20 min后取出，沿視交叉向前冠狀位平行依次切片2 mm×5片。將切好的腦片放置在2%TTC磷酸緩沖液中，恒溫箱37℃避光孵育30 min后，用4%多聚甲醛固定。用數碼相機拍照后輸入計算機，應用圖像分析軟件計算腦梗死體積百分比。梗死體積百分比=(左側正常腦組織體積-右側正常腦組織的體積)/左側正常腦組織體積×100%，以此作統計分析。

1.2.2 實驗動物取材及HE染色標本的制備 4%多聚甲醛(4℃)將大鼠灌流固定斷頭取腦后，將腦組織浸入4%多聚甲醛(4 ℃預冷)中固定24 h，常規梯度乙醇脫水、石蠟包埋。將包埋好的腦組織在恒溫切片機上沿冠狀面連續切片，片厚約5 μm，展片、撈片后置于載玻片上放在4 ℃冰箱保存備用。在70 ℃烤箱中烘烤30 min常規脫蠟，二甲苯及梯度乙醇脫蠟至純水，Harris蘇木素染色15 min，自來水沖洗；1%鹽酸乙醇分化3～5 s，自來水沖洗返藍；伊紅染色1 min，自來水沖洗。脫水、透明、中性樹膠封片。

1.2.3 腦組織線粒體的提取 利用差速離心法提取線粒體。麻醉后迅速處死動物取腦，去除腦膜、小腦，嗅球、腦干后，留取右側大腦半球，冰鹽水沖去血液，用小剪刀于冰浴的小燒杯中將腦組織剪成邊長約3 mm的小塊，應用緩沖液(0.1 mol/ L Tris-HCl，pH 7.4，0.25 mol/L Sucrose，0.01 mol/ L EGTA)按9∶1比例混合后，轉移至預冷的玻璃勻漿器中，上下均勻勻漿10次制成10%勻漿(避免出現氣泡)。低溫高速離心機(溫度4 ℃)以7650 rpm轉速離心20 min后，取上清液再以8400 rpm轉速離心20 min后，取沉淀物加入線粒體保存液充分震蕩，反復吹打，得到線粒體懸浮液。上述操作均4 ℃下進行[4]。Lowry法檢測蛋白濃度。

1.2.4 線粒體丙二醛及ATP酶測定 丙二醛監測采用硫代巴比妥酸(TBA)方法。丙二醛(結構OHC-CH2-CHO)與硫代巴比妥酸反應后產物，在532 nm處有最大吸收峰。ATP酶即三磷酸腺苷酶，ATP酶分解ATP為ADP和無機磷，無機磷在660nm處有最大吸收峰。取腦線粒體懸浮液監測，具體檢測步驟按照試劑盒說明書操作。

2 結 果

2.1 腦梗死體積 假手術組雙側腦組織均勻紅染，未發現梗死灶；IR組和丹參多酚酸組可見右側大腦半球不同范圍的蒼白色梗死灶。丹參多酚酸組腦梗死體積顯著小于IR組(P<0.05)(見圖1)。

注：與缺血再灌組相比*P<0.05

2.2 光鏡下觀察大鼠腦組織神經元形態學變化 假手術組(見圖2)神經元胞質呈深紅色，胞核呈藍色。細胞形態正常，邊界清楚，核大而圓，核膜、核仁清晰可見。缺血再灌注組(見圖3)神經細胞排列紊亂，呈缺血性改變的錐體細胞，胞體腫脹變形成多角形、核固縮；丹參多酚酸組(見圖4)干預后神經細胞缺血性改變程度均較缺血再灌注組輕，間質水腫明顯減輕，神經細胞及細胞間質水腫明顯減輕，細胞核基本正常，核仁較清晰，可見少量神經細胞形態異常、核固縮或消失。

圖2 假手術組

圖3 缺血再灌注組

各組大鼠腦組織神經元形態學變化(HE染色 ×200)

2.3 丙二醛測定 丹參多酚酸治療組顯著抑制缺血再灌注后線粒體膜損傷。與缺血再灌注組相比，丹參多酚酸治療組丙二醛含量(0.901±0.472)顯著減少(P<0.05)；與假手術組相比，缺血再灌注組丙二醛含量(1.501±0.149)顯著增多(P<0.05)。(見圖5)

2.4 線粒體ATP酶的影響 缺血再灌注組Na+/K+ATP酶(2.968±0.178)，Ca2+ATP酶(3.641±0.145)，Mg2+ATP酶(1.055±0.153)與假手術組相比明顯下降(P<0.05)；與缺血再灌注組相比，丹參多酚酸組Na+/K+ATP酶(5.032±0.154)，Ca2+ATP酶(4.987±0.122)，Mg2+ATP酶(2.503±0.260)能提高線粒體ATP酶活性(P<0.05)(見圖6)。

注：與缺血再灌組相比*P<0.05)；缺血再灌注組與假手術組相比P<0.05

圖5 丹參多酚酸組對線粒體丙二醛的影響

注：Na+/K+ATP酶：*與缺血再灌組相比(P<0.05)；Ca2+ATP酶：#與缺血再灌組相比(P<0.05)；Mg2+ATP酶：**與缺血再灌組相比(P<0.05)

圖6 丹參多酚酸對線粒體ATP酶的影響

3 討 論

我們實驗發現，缺血再灌注后大鼠腦線粒體丙二醛含量升高，線粒體Na+/K+ATP酶、Ca2+ATP酶、Mg2+ATP酶活性降低，提示線粒體膜破壞，線粒體ATP酶功能障礙；HE切片上可以看到神經細胞胞體腫脹變形，核固縮，神經元細胞減少，TTC染色可見腦梗死體積明顯增加。近年來研究發現，腦缺血時線粒體功能障礙是神經損傷的關鍵因素。正常情況下，線粒體依賴線粒體膜上ATP酶維持線粒體內Na+、K+、Ca2+及線粒體內膜電位平衡。腦缺血時，細胞無氧酵解，缺血區乳酸堆積，缺血區PH值降低，抑制三羧酸循環，而且組織內H離子增加激活Na+/ H+交換。Na+內流，線粒體膜電位下降，線粒體內離子平衡破壞，ATP合成受抑制，尤其是再灌注時大量活性氧產生，損害線粒體細胞膜，線粒體結構性破壞，導致ATP合成進一步減少[5]。線粒體能量障礙引起線粒體膜上依靠ATP能量的Na+/K+ATP酶、Ca2+ATP酶、Mg2+ATP酶活性降低；Na+/K+ATP酶不能維持線粒體內K+梯度優勢，引起Na+內流，Na+過度引起Na+/ Ca2+交換，Ca2+進入線粒體，引起鈣超載[6]。Ca2+ATP酶和Mg2+ATP酶依靠ATP能量將Ca2+泵出，線粒體鈣平衡；線粒體損傷時線粒體膜破壞，ATP合成減少，線粒體內Ca2+溶度增加，引起線粒體鈣超載，觸發線粒體通透型轉化孔開放[6]。線粒體通透型轉化孔開放引起分子量大于1500Da的物質自由通過線粒體內膜，引起線粒體腫脹，線粒體外膜破裂，釋放細胞色素C、Smac/DIABLO、核酸內切酶G等促凋亡物質釋放[7]；而且鈣超載激活依賴鈣離子降解酶，導致細胞結構破壞，細胞災難性損傷[8]。

注射用丹參多酚酸是采用柱層析技術提取的丹參水溶成分，其主要有效成分是丹酚酸B。實驗研究表明，丹參多酚酸通過上調高爾基磷酸化蛋白-3表達，激活Akt和mTOR磷酸化途徑減少TUNEL細胞起到腦保護作用[9]。我們研究發現，丹參多酚酸組丙二醛含量減少，Na+/K+ATP酶、Ca2+ATP酶、Mg2+ATP酶活性升高，與缺血再灌組相比，腦梗死體積明顯較少，HE接片神經細胞及細胞間質水腫明顯減輕，細胞核基本正常，核仁較清晰。因此我們認為，提高線粒體ATP酶活性，維持線粒體離子平衡，保護線粒體膜穩態可能是注射用丹參多酚酸發揮腦保護作用的主要機制。

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