松齡血脈康聯合脈血康預處理對大鼠全腦及血清IL-6表達的影響

梁汝慶， 姜 婧， 丁新生

腦缺血再灌注后，缺血的神經元、小膠質細胞和星形膠質細胞分泌大量的炎性因子，IL-6 是其中很重要的細胞因子[1～4]。大量研究均支持炎癥反應參與了缺血性腦損傷，它是由多種細胞因子介導的一種連鎖過程[5]。沈等[6]研究結果提示炎癥反應遍及全腦并作用全身，貫穿腦缺血再灌注整個病理過程。本實驗采用松齡血脈康聯合脈血康對大鼠進行4 w預處理，在相同時間點采用線栓法制作大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，觀察大鼠神經功能缺損狀況，檢測腦組織和血清IL-6濃度及缺血側腦組織水含量及梗死體積，旨在了解松齡血脈康聯合脈血康預處理對局灶性腦缺血-再灌注后IL-6表達變化以及腦水腫和腦梗死體積的影響，為松齡血脈康聯合脈血康在缺血性卒中預防中的神經保護作用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性SPF級SD大鼠75只，1月齡，體重(110±10)g，由中國科學院上海實驗動物中心提供[許可證號SCXK(滬)2007-0005]，在GB14925-2001標準環境飼養。大鼠采用隨機數字表法隨機分為松齡血脈康預處理組(SL-xmk)，脈血康預處理組(M-xk)、松齡血脈康聯合脈血康預處理組(SL-M)、假手術組和生理鹽水對照組，每組n=15。SL-xmk組應用松齡血脈康干粉(由成都康弘藥業有限公司提供，批號090301)加生理鹽水配制成懸浮液灌胃(937.5 mg/kg)[ 7]；M-xk組采用脈血康膠囊(貴州信邦制藥股份有限公司，國藥準字Z20090723)加生理鹽水配制成懸浮液[1000.0 mg/(kg·d)][ 8 ]。SL-M組采用SL-xmk懸浮液[937.5 mg/(kg·d)]加M-xk懸浮液[1000.0 mg/(kg·d)]聯合應用，以上三組預防性灌胃4 w。假手術組和生理鹽水對照組均給予等容量生理鹽水灌胃(1 ml/100 g)，預處理時程同藥物預防組。

1.2 MCAO模型制備 在預處理時程終點，參照Longa等[9，10]的方法制作大鼠右側大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型。以10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，逐層鈍性分離右側頸總動脈、頸外動脈及頸內動脈，在頸總動脈近心端距分叉處0.5 cm處剪一0.2 mm左右小口，將一段長5 cm，頭端加熱成直徑約0.28 mm光滑球型的4-0號單絲尼龍魚線栓自頸總動脈切口處插入，輕柔推進，使其沿頸內動脈入顱，線頭進入約(18.0±0.5)mm后感到一定的阻力時即停止進線。插線成功后，結扎頸總動脈、頸內動脈固定尼龍線栓，縫合頸部切口。假手術組不插入線栓，其他步驟相同。血流阻斷2 h后緩緩拔出線栓，再灌注24 h后處死動物進行各項檢測。術中和術后用白熾燈保持肛溫(37.0±0.5)℃范圍內，直至動物蘇醒。

1.3 神經功能評價 動物蘇醒后采用Longa等[9]報道的5級標準評分法進行神經功能評價，分別于再灌注2 h、6 h、24 h時評分。0分：無神經功能缺損；1分：缺血對側前肢內收、不能完全伸展；2分：行走時向偏癱側轉圈；3分：行走時向偏癱側傾的；4分：意識喪失，不能自發行走。≥1分說明模型制作成功，評分0分和4分以及出現癲癇發作和取材時發現腦出血者均剔除，隨機補充。

1.4 大鼠血清抽取及腦組織勻漿制備 每組取5只大鼠，末次給藥24 h內給予10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，迅速打開胸腔，充分暴露心臟(以5 ml注射器抽取心尖部血液3 ml，37 ℃水浴30 min后，3000 r/min離心10 min，留取血清備用)。開顱取腦，以萬分之一電子天平準確稱取大鼠缺血區和健側相同部位腦組織100 mg加入1 ml 0.9%生理鹽水，在組織勻漿器中研磨，制備成10%組織勻漿，全部勻漿過程在4 ℃冰浴環境下完成。

1.5 ELISA法檢測大鼠腦組織及血清IL-6[6]取備用血清，嚴格按照ELISA試劑盒說明操作，根據已知濃度的人IL-6(試劑盒提供)進行梯度稀釋并測定450 nm吸光度，制定標準曲線。標準及檢測標本均采用復孔，復孔測定的吸光度值取均數減去零標準孔吸光度值的均數作為該濃度標準濃度或檢測標本的測定值，進一步通過標準曲線和稀釋倍數計算出濃度濃度。

1.6 腦水含量和梗死體積百分比的測定[10]腦水含量采用干濕重法檢測：每組取5只大鼠，斷頭取腦，左右腦分開，取右腦，除去小腦和低位腦干和嗅球，立即用雙量程電子分析天平稱濕重，然后在電熱恒溫干燥箱中106 ℃干燥48 h后稱量干重。腦水含量計算公式為：水含量=(濕重-干重) /濕重×100%。

腦梗死體積采用氯化三苯基四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chlorid，TTC)染色法檢測：每組取5只大鼠，斷頭取腦，置-4 ℃冰箱30 min，從額極致枕極沿冠狀面切成厚度基本相同的5片，腦片避光置于30 ml 2% TTC溶液(Sigma公司)中20 min，然后用10%甲醛溶液固定腦片。正常組織呈紅色，梗死腦組織呈蒼白色。分離蒼白區和非蒼白區計算梗死百分比。計算公式為：梗死百分比(%) =蒼白區重/(蒼白區重 +非蒼白區重) ×100%。

2 結 果

2.1 藥物預處理對腦缺血再灌注大鼠神經功能評分的影響 假手術組大鼠神經功能正常。藥物預處理組2 h、6 h、24 h神經功能缺損評分較生理鹽水對照組均降低(P<0.05)。SL-M預處理組2 h、6 h、24 h神經功能缺損評分較SL-xmk、M-xk組均降低(P<0.05)(見表1)。

2.2 大鼠腦組織和血清IL-6含量 對照組缺血側腦組織勻漿IL-6濃度明顯增高，與假手術組相比差異有統計學意義(P<0.05)。藥物預處理各組缺血側腦組織勻漿IL-6濃度較對照組明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；SL-M組較對照組降低較顯著，且優于SL-xmk和M-xk組，差異有統計學意義(P<0.05)。健側腦組織兩者的變化趨勢與缺血側大致相同。假手術組血清IL-6濃度較低[23.08±4.24pg/ml]，對照組大鼠血清IL-6濃度升高，與假手術組比較有統計學意義(P<0.05)；但升高幅度不如腦組織明顯。藥物預處理各組大鼠血清IL-6濃度與生理鹽水對照組相比顯著降低(P<0.05)，SL-M組降低更顯著，優于SL-xmk和M-xk組(見表2)。

表1 各組大鼠神經功能評分

注：與對照組比較★P<0.05；與SL-xmk、M-xk比較▲P<0.05

表2 各組大鼠腦組織和血清IL-6含量變化

注：與假手術組比較★P<0.05；對照組比較▲P<0.05；與SL-xmk組、M-xk組比較▲▲P<0.05

2.3 腦水含量和梗死率測定 假手術組大鼠腦組織正常，腦水含量為(56.46±5.74)%。藥物預處理組腦水含量較生理鹽水對照組顯著降低(P<

0.05)，梗死體積顯著縮小(P<0.05)，SL-M組較對照組降低較顯著，且優于SL-xmk和M-xk組，二者相比有統計學差異(P<0.05)(見表3)。

組別例數腦水含量梗死體積假手術組對照組SL-xmk組M-xk組SL-M組5555556.46±5.7487.81±8.65★76.01±7.16▲74.62±7.65▲63.64±6.11▲▲035.61±5.31★28.45±4.47▲27.23±4.58▲20.88±4.28▲▲

注：與假手術組比較★P<0.05；對照組比較▲P<0.05；與SL-xmk組、M-xk比較▲▲P<0.05

3 討 論

腦梗死后缺血區的炎癥反應主要表現在白細胞聚集、氧自由基產生、溶酶體破壞、水解酶生成以及炎癥介質形成等方面。腦缺血-再灌注(I-R)時的炎癥反應促進了繼發性腦損害，隨著腦I-R炎癥機制研究的深入，炎性細胞和炎性因子在其中的作用越來越受到重視。腦缺血-再灌注后內皮細胞炎癥反應使血腦屏障受損，加重了腦損害及腦水腫，此病理生理過程的基礎是以IL-6等細胞因子為代表的多種炎性介質失控、釋放而形成的“瀑布效應”機制[11]。Vila等[12]應用雙夾心 ELISA 法對231例急性腦梗死患者的血清白細胞介素6含量進行檢測，并采用Logistic多元回歸分析后發現，腦脊液和血清中白細胞介素6是腦梗死的獨立預測因子，與體溫、血糖、纖維蛋白原和腦梗死體積密切相關，腦梗死體積越大，血清白細胞介素6水平越高，而與腦梗死發生部位無關[13]。

松齡血脈康采用松針、珍珠層粉、葛根等成分，經現代制劑技術加工、精制而成的復方中藥制劑；主要有效成分為原花青素、葛根素、總黃酮等，羅氏等[14]通過基因芯片技術發現，松齡血脈康作用于自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)后可促進或抑制許多基因的轉錄改變，而這些基因在調控脂代謝、氧化應激、細胞凋亡、心肌細胞發育和分化等方面起了重要作用。郭等[15]從氧化應激損傷方面證實松齡血脈康對腦缺血-再灌注損傷有明顯保護作用。我們已有研究結果表明松齡血脈康可通過抗細胞凋亡、抑制炎癥反應發揮腦保護作用[7，16，17]。國外研究提示松樹制劑能刺激e-NOS活性，增加NO濃度，提高血漿前列環素，降低內皮縮血管肽1和血栓烷，擴張血管和抗炎的作用[18，19]。

脈血康膠囊是采用醫用水蛭活體經低溫冷凍加工而成的膠囊劑，現代藥理研究證實水蛭的主要有效成分為水蛭素，由水蛭唾液腺分泌的含65 個氨基酸的酸性多肽，是高度特異的凝血酶抑制劑，與凝血酶結合后，能抑制凝血酶與血栓調節蛋白的結合作用，阻止纖維蛋白原和纖維蛋白和血細胞結合形成血凝塊[20]；水蛭素可降低血液黏稠度，降低血漿中纖維蛋白原的含量[21]；還可降低血小板表面活性，抑制血小板黏附和聚集[22]；其抗凝作用不依賴于抗凝血酶Ⅲ，對已生成的凝血酶也可起作用，故其抗凝活性可能優于肝素[23]。水蛭素是迄今為止世界上發現最強的天然凝血酶特異性抑制劑[24]，由于它安全且沒有副作用，因而比肝素更有優越性[25]。

本實驗采用松齡血脈康聯合脈血康預防性給藥，在相同時間點采用線栓法建立缺血-再灌注大鼠模型，模擬人類缺血性卒中再灌注狀態，于再灌注2 h、6 h、24 h后觀察大鼠神經功能缺損癥狀，檢測腦組織和血清IL-6濃度，同時檢測缺血側腦組織含水量、梗死體積，了解松齡血脈康聯合脈血康預處理對局灶性腦缺血-再灌注后炎性細胞因子表達變化、作用部位，以探討其炎癥反應作用機制。

實驗結果顯示，松齡血脈康聯合脈血康預處理后MCAO大鼠，與對照組與單藥預處理組比較，聯合用藥預處理組大鼠神經功能缺損評分降低，全腦及血清中IL-6濃度均降低，與對照組、松齡血脈康、脈血康組比較差異有顯著性意義。實驗過程中我們觀察到松齡血脈康聯合脈血康預處理組在MCAO后，缺血側腦組織含水量、腦梗死體積率均較對照組、松齡血脈康、脈血康組降低，且差異有統計學意義。對照組腦組織和血清中IL-6表達均高于假手術組，提示IL-6是一種致炎細胞因子，缺血早期對腦水腫及腦梗死體積有一定影響，與已有研究相一致[6，26]，我們也發現缺血再灌注大鼠的健側腦組織同時伴隨著高水平的IL-6 表達。這可能是由于：(1)缺血再灌注過程一方面刺激全身性循環系統單核-巨噬細胞系分泌IL-6增加；另一方面缺血再灌注側局灶性的炎癥反應可以通過神經元軸突傳遞和釋放，產生級聯效應，激活全腦的炎癥反應；(2)缺血側腦組織水腫導致腦中線移位，健側腦組織受壓、缺血，從而引起炎性因子分泌增加。我們分析可能的機制為：(1)IL-6上調血管內皮細胞和白細胞上的粘附因子(ICAM-1) 的表達，引起血管炎性反應，加重腦缺血；(2)使血腦屏障的通透性增加，腦組織水腫；(3)通過細胞因子的級聯效應，加劇腦組織的炎癥反應，釋放大量的毒性物質，加重神經細胞的壞死[27]。本實驗結果顯示松齡血脈康聯合脈血康預處理后抑制了大腦中動脈閉塞大鼠腦組織中IL-6的高表達，減輕了腦水腫和腦梗死體積，改善了神經功能，降低了全腦及外周血清IL-6的濃度，發揮了一定的抗炎癥反應作用。

綜上所述，松齡血脈康聯合脈血康預處理大鼠MCAO后，血清和腦組織IL-6表達均降低，缺血腦組織水濃度、梗死體積及神經功能均有改善，提示松齡血脈康聯合脈血康預處理不僅可抑制大鼠腦缺血再灌注后腦組織IL-6的表達，而且可抑制局部腦組織損傷引起的全身毒血反應，減輕腦水腫和腦梗死體積，改善神經損傷，為松齡血脈康聯合脈血康防治缺血性卒中提供了治療的理論依據。

[參考文獻]

[1]Dirnagl U，Iadecola C，Moskowitz MA. Pathobiology of ischaemic stroke：an integrated view[J]. Trends Neurosci，1999，22(9)：391-397.

[2]Vikman P，Ansar S，Henriksson M，et al. Cerebral ischemia induces transcrip tion of inflammatory and extracellular-matrix-related genes in rat cerebral arteries[J]. Exp Brain Res，2007，183(4)：499-510.

[3]Beridze M，Shakarishvili R，Gogokhia N. Probable role of immunological tolerance to ischemia injury in brain[J]. Georqian Med News，2008(163)：30-35.

[4]Suzuki S，Tanaka K，Suzuki N. Ambivalent aspects of interleukin-6 in cerebral ischemia：inflammatory versus neurotrophic aspects[J]. Cereb Blood Flow Metab，2009，29(3)：464-479.

[5]張冬梅，劉舉祥，陳紅兵. NF-κB和 IL-6在局灶腦缺血 /再灌注損傷大鼠腦組織中的表達[J]. 中國老年學雜志，2005，25(11)：1364-1366.

[6]沈麗華，葉 民，丁新生，等. 大鼠腦缺血再灌注后全腦及血清炎性因子水平研究[J]. 中風與神經疾病雜志，2009，26(4)：456-458.

[7]梁汝慶，姜 婧，丁新生，等. 松齡血脈康對大鼠局灶性腦缺血-再灌注損傷和細胞凋亡的影響[J]. 中國新藥與臨床雜志，2010，29(3)：221-224.

[8]徐德友，印衛兵，沈華超，等. 脈血康聯合阿司匹林預處理對大鼠腦缺血-再灌注損傷的影響[J]. 江蘇醫藥，2013，39(19)：2244-2246.

[9]Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke，1989，20(1)：84-91.

[10]沈麗華，葉 民，丁新生，等. 大鼠腦缺血再灌注后腫瘤壞死因子-α與腦水腫的相關性研究[J]. 國際腦血管病雜志，2009，17(11)：840-843.

[11]Jean WC，Spellman SP，Nussbaum ES，et al. Reperfusion injury after focal cerebral ischemia：the role of inflammation and the therapeutic horizon[J]. Neurosurgery，1998，43(6)：1382-1397.

[12]Vila N，Castillo J，Dávalos A，et al. Proinflammatory cytokines and early neurological worsening in ischemic stroke[J]. Stroke，2000，31(10)：2325-2329.

[13]Shenhar-Tsarfaty S，Ben Assayag E，Bova I，et al. Interleukin-6 as an early predictor for one-year survival following an ischaemic stroke/transient ischaemic attack[J]. Int J Stroke，2010，5(1)：16-20.

[14]羅弟祥，閃建成，張順華，等. 自發性高血壓大鼠基因表達變化及松齡血脈康對其的影響[J]. 中西醫結合心腦血管病雜志，2008，6(7)：804-806.

[15]郭沛鑫，陽 勇，蘇 芝，等. 松齡血脈康膠囊對腦缺血-再灌注損傷的保護作用[J]. 中西醫結合心腦血管病雜志，2009，7(1)：64-65.

[16]梁汝慶，華 燁，丁新生，等. 松齡血脈康預處理對腦缺血再灌注大鼠全腦及血清IL-6表達的影響[J]. 中風與神經疾病雜志，2013，30(7)：625-628.

[17]梁汝慶，孫 波，丁新生，等. 松齡血脈康預處理對腦缺血再灌注大鼠腦組織基質金屬蛋白酶-9表達的影響[J]. 國際腦血管病雜志，2011，19(2)：122-126.

[18]Cisár P，Jány R，Waczulíková I，et al. Effect of pine bark extract (pycnogenol) on symptoms of knee osteoarthritis[J]. Phytother Res，2008，22(8)：1087-1092.

[19]Zibadi S，Rohdewald PJ，Park D，et al. Reduction of cardiovascular risk factors in subjects with type 2 diabetes by Pycnogenol supplementation[J]. Nutr Res，2008，28(5)：315-320.

[20]張 彬，汪 波，龔 元，等. 幾種水蛭抗凝血物質提取及活性分析[J]. 中山大學學報(自然科學版)，2012，51(4)：92-96.

[21]李 彬，李小利. 脈血康膠囊對腦梗死患者血纖維蛋白原的影響及療效觀察[J]. 中西醫結合心腦血管疾病雜志，2008，6(8)：993.

[22]阮海娃，暢亦杰. 脈血康膠囊治療急性腦梗死112 例臨床療效觀察[J]. 中國中藥雜志，2011，36(5)：642-643.

[23]劉青峰，暢亦杰. 脈血康膠囊聯合低分子肝素鈣治療骨折術后下肢深靜脈血栓形成的臨床觀察[J]. 中國中藥雜志，2011，36(7)：945-947.

[24]Greinacher A，Warkentin TE. The direct thrombin inhibitor hirudin[J]. Thromb Haemost，2008，99(5)：819-829.

[25]高麗娟，楊 喬，王 崢，等. 脈血康膠囊對高脂血癥大鼠脂質代謝及黏附分子表達的影響[J]. 中成藥，2013，35(1)：1-4.

[26]Waje-Andreassen U，Kr?kenes J，Ulvestad E，et al. IL-6：an early marker for outcome in acute ischemic stroke[J]. Acta Neurol Scand，2005，111(6)：360-365.

[27]Wang CX，Shuaib A. Involvement of inflammatory cytokinesin central nervous system injury[J]. Prog Neurobiol，2002，7(2)：161 -172.