組織蛋白酶S對犬頸動脈支架置入后再狹窄的影響及法舒地爾對其干預的研究

黃惠英， 鄭 輝， 楊 樹， 劉 丹， 郭富強

近年來，頸動脈支架成形術(carotidartery angioplasty and stenting，CAS)已廣泛應用于頸動脈狹窄治療。同時，人們也認同頸動脈支架成形術治療頸動脈狹窄的安全性和有效性[1]。但是，頸動脈支架成形術術后6 m內有約20%～30%患者出現血管內再狹窄，遠期觀察血管內再狹窄機率更高。有研究表明血管成形術后血管再狹窄多好發于術后3～6 m，嚴重影響該手術方式遠期療效[2]。

新生內膜形成在血管成形術后再狹窄的形成過程中起著重要作用[2]，而VSMCs(血管平滑肌細胞vascular smooth muscle cells，VSMCs)從中膜向內膜遷移是新生內膜形成的一個關鍵原因。在VSMCs遷移的過程中，細胞通過表達包括基質金屬蛋白酶、組織蛋白酶等多種蛋白酶降解和破壞細胞外基質(extracellular matrix ECM)和內彈力板，從而實現細胞遷移[3]。已有細胞培養實驗表明組織蛋白酶主要由單核細胞來源的巨噬細胞和活化的平滑肌細胞分泌[4]；降解彈性組織的活性主要依賴于組織蛋白酶，這些實驗還表明組織蛋白酶在平滑肌細胞、內皮細胞和巨噬細胞的粘附、增殖和遷移過程中都發揮了重要作用，而這些過程都發生在血管成形術后血管重塑過程中，阻滯這些酶的表達可能降低ECM的降解和積聚，從而降低血管成形術后再狹窄形成的程度和進程。組織蛋白酶能分解彈力蛋白，在動脈粥樣硬化及其斑塊不穩定性中的作用目前已經成為研究熱點，然而在血管成形術后再狹窄血管重塑中的作用尚不清楚。組織蛋白酶S (Cathepsin S，CatS)能促進細胞外基質多種成分降解[5]，具有顯著的彈力纖維和膠原纖維水解活性，可以長時間在中性條件下保持蛋白水解活性，并參與各種生理病理過程。因此，Cat S具有在細胞內外發揮更大生理功能潛力[6]。已有研究表明[7，8]，在大鼠頸動脈球囊損傷和兔頸動脈球囊損傷加高脂飲食飼養后，血管壁Cat S明顯表達。這些研究提示Cat S在新生內膜形成中發揮重要作用。但是，血管成形術后再狹窄中研究很少，特別是支架置入術后再狹窄研究，目前國內外尚未有相關報道。

Cat S及其抑制劑在AS中的作用已廣泛受到人們關注。Matsumoto等[9]首先報道了Rho激酶在再狹窄和Rho激酶抑制劑法舒地爾在防治再狹窄中的潛在效果，該研究表明在支架置入術后28 d，法舒地爾能顯著抑制支架置入部位巨噬細胞聚集、膠原蛋白沉積。有研究表明[4]，Cat S主要由單核細胞來源的巨噬細胞和活化的平滑肌細胞分泌，法舒地爾是否可以通過抑制Cat S的表達，從而抑制新生內膜的形成，目前國內外尚未見相關研究。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 雄性比格犬12只，硫酸氫氯吡格雷片、鹽酸法舒地爾注射液等。

1.2 實驗方法 雄性比格犬12只，隨機分為A組(假手術組n=4，經前期假手術處理)，B組(裸支架組n=4，經前期頸動脈粥樣硬化狹窄造模)，C組(裸支架+fasudil組n=4，經前期頸動脈粥樣硬化狹窄造模)。在支架置入術前24 h及支架置入術后1 w喂食阿司匹林腸溶片300 mg/d，氯吡格雷片25 mg/d，之后改為喂食阿司匹林腸溶片100 mg/d，氯吡格雷片25 mg/(d·只)，直至取血管標本。所有實驗比格犬在造模后高脂飲食喂養2 m后進行造影檢查，并將8枚金屬裸支架置入B組和C組的比格犬頸總動脈最狹窄處。 C組在支架置入后2 h開始給予靜脈輸注法舒地爾，共7 d，其余組均給予同等劑量的生理鹽水靜脈滴注。在支架置入后7 d，2 m時對A組、B組和C組比格犬進行頸動脈彩超檢查，了解頸動脈狹窄程度及支架置入后頸動脈情況。最后取血管標本進行結果分析。

1.3 頸動脈的結果分析 將取出的血管行石蠟包埋，顯微鏡下觀察，新生內膜組織完整者可作為分析對象。通過HE染色和彈力纖維染色病理形態學，分析了解頸動脈支架置入后再狹窄情況；RT-PCR檢測比格犬頸動脈中CatS mRNA表達情況；免疫組化觀察血管中α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)和增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)表達情況；通過彩超與DSA檢測血管的內徑和斑塊情況，了解血管的狹窄情況和支架的安置情況。

2 結 果

2.1 DSA數據分析 支架置入術前DSA顯示，B組和C組管腔狹窄率顯著高于A組(P<0.05)，B組狹窄率和C組相似(P>0.05)。支架置入后2 mDSA示A組管腔光滑，無狹窄形成，B組狹窄率顯著大于C組(P<0.05)(見圖1，表1)。

2.2 比格犬頸動脈組織形態學的變化

2.2.1 HE染色 光鏡下A組(假手術組)比格犬頸動脈中膜由3～5層環行排列的彈性膜和平滑肌細胞組成，外膜由結締組織組成，內彈力膜呈波浪狀，內膜僅內襯單層內皮細胞，無新生內膜形成。與假手術組相比，B組、C組中膜平滑肌細胞層稍紊亂，內膜增生明顯，新生內膜內可見平滑肌細胞(見圖2)。

2.2.2 彈力纖維染色結果分析 A組血管無新生內膜形成，B、C組血管見大量新生內膜形成，B組新生內膜厚度、面積、狹窄率均大于C組，差異有統計學意義(見表2)。結合HE染色結果，可以看出新生內膜中細胞的成分較少，主要為細胞外基質成分(見圖3、表2)。

2.3 比格犬頸動脈支架置入后2 m時Cat S mRNA的表達的比較 支架置入后2 m時頸動脈RT-PCR示Cat S mRNA在A組中有少量表達，而在B組和C組中表達水平明顯升高，且和A組相比，差異均有統計學意義，B組和C組比較，B組Cat S mRNA表達水平明顯高于C組，差異有顯著統計學意義(見圖4)。

2.4 免疫組化結果分析

2.4.1 頸動脈α-SMA的免疫組化表現 A組表現為中膜α-SMA染色陽性較多，無新生內膜形成。 B、C組中膜中膜和新生內膜上均可見α-SMA染色陽性的平滑肌細胞，表明平滑肌細胞突破基底膜，遷移到內彈力膜外增殖，是新生內膜的主要組成細胞(見圖5)。α-SMA新生內膜平均光密度值檢測結果示：B組新生內膜中α-SMA平均光密度值高于C組，差異有統計學意義(見表3)。

2.4.2 頸動脈PCNA的免疫組化表現 A組PCNA免疫組化陽性染色顆粒表達偶見于血管外膜，中膜表達較少。B、C組在支架周圍及新生內膜中PCNA陽性表達較多(見圖5)。新生內膜PCNA平均光密度值結果顯示B組新生內膜上PCNA高于C組，差異有統計學意義。

2.5 統計學處理 采用Pearson相關系數對各指標的相關性進行分析，Cat S mRNA與α-SMA、PCNA、內膜厚度呈正相關。

a：支架置入術前DSA示管腔明顯狹窄；b：支架置入術后10 min DSA示狹窄解除

圖1 支架置入前后DSA檢查結果

注：I：代表內膜；M：代表中膜。a：A組血管未見新生內膜形成；b：B組血管見新生內膜形成；c：C組血管見新生內膜形成

圖2 各組支架置入后2 m血管HE染色(×40倍)

注：I：代表內膜；M：代表中膜 標尺為100 μm。a：A組血管未見新生內膜形成；b：B組血管見新生內膜形成；c：C組血管見新生內膜形成

圖3 各組支架置入后血管2 m彈力纖維染色(×40倍)

注：A組代表假手術組，B組代表裸支架組，C組代表裸支架+fasudil組。A組相比*P<0.05；與C組相比#P<0.05。

圖4：各組支架置入后2 m比格犬頸動脈Cat S mRNA值

注：I：代表內膜；M：代表中膜。a：A組可見中膜α-SMA染色陽性；b：B組中膜和內膜上可見α-SMA染色陽性；c：C組中膜和內膜上可見α-SMA染色陽性；d：A組中膜上未見PCNA染色陽性；e：B組內膜上可見PCNA染色陽性；f：C組內膜上可見PCNA染色陽性

圖5 支架置入2 m后血管α-SMA和PCNA免疫組化(×200倍)

注：A組代表假手術組，B組代表裸支架組，C組代表裸支架+fasudil組。*代表P值A組VS B組，#代表P值A組 VS C組，&代表P值B組 VS C組。P<0.05為差異有統計學意義

表2 支架置入后2 m病理形態學分析

注：A組代表假手術組，B組代表裸支架組，C組代表裸支架+fasudil組。*代表P值A組 VS B組，#代表P值A組 VS C組，&代表P值B組 VS C組。P<0.05為差異有統計學意義。標尺為100 μm

組別α-SMAPCNAA(n=4)B(n=4)C(n=4)F值P值0.000±0.000927.417±157.767468.000±168.01848.5760.000*0.001#0.001&0.000±0.000242.833±68.650110.083±69.30118.6450.000*0.022#0.009&

注：A組代表假手術組，B組代表裸支架組，C組代表裸支架+fasudil組。*代表P值A組VS B組，#代表P值A組VS C組，&代表P值B組VS C組。P<0.05為差異有統計學意義

3 討 論

目前，對支架置入后再狹窄的動物實驗研究，大多是以血管球囊損傷術為基礎，支架與血管中層直接接觸[10]，而在人類患者中支架則與動脈粥樣硬化斑塊直接接觸。因此，既往動物實驗研究不能很好的模擬臨床中支架置入術后再狹窄病理生理變化過程。本實驗通過對比格犬進行頸總動脈粥樣硬化狹窄造模后置入支架，研究支架置入后比格犬頸動脈Cat S表達情況，以及法舒地爾對Cat S表達的影響，為支架置入后再狹窄的防治提供了新思路。

法舒地爾于1995在日本首次被批準用于臨床的Rho激酶抑制劑，通過競爭性抑制ATP與Rho激酶結合選擇性抑制Rho激酶活性[11]。目前已有研究表明，法舒地爾可通過多種機制參與抑制支架術后內膜形成，包括抑制血管炎性反應、抑制VSMCs增殖和遷移、增加凋亡，以及減少膠原蛋白沉積等[12]。本實驗通過在支架置入后急性期靜脈輸注法舒地爾干預支架置入后的再狹窄進程，對支架置入后2 m DSA和頸動脈病理形態學的結果分析表明，B組(裸支架組)再狹窄率顯著高于C組(裸支架+fasudil組)，表明法舒地爾可以抑制支架置入后再狹窄的進程。本實驗研究結果與既往研究結果類似，進一步提示法舒地爾可以抑制支架術后再狹窄進程。

支架置入后再狹窄的形成主要由新生內膜增生所致[13]。動物模型和人類尸檢表明血管支架置入后的病理生理機制和傷口愈合的病理生理機制相似[14]。傷口愈合的過程劃分為3個過程：炎性反應(數小時至數天)，肉芽形成或細胞增殖階段(數天至數周)，以及細胞外基質的重塑(數月)[14]。既往研究[15]表明，血管損傷后形成的新生內膜中，細胞外基質占89%，細胞僅占11%。 本實驗頸動脈HE染色和彈力纖維染色結果表示，假手術組內彈力膜外僅覆蓋單層內皮細胞，而支架置入2 m后的B組(裸支架組)和C組(裸支架+fasudil組)頸動脈內彈力膜外均可見新生內膜形成，其中細胞的含量較少，主要成分為膠原蛋白等細胞外基質，這與既往的研究結果一致。且B組的新生內膜厚度及面積均大于C組，表明法舒地爾可以通過抑制新生內膜的形成來抑制再狹窄的形成進程。

再狹窄形成過程中一個關鍵的機制是VSMC分化缺失，使之成為能夠增殖和遷移的平滑肌細胞[13]。血管平滑肌細胞在出生后保持著顯著的血管可塑性功能，能由收縮型轉化為分泌型。對人類PTCA術后再狹窄血管的研究[13]顯示，新生內膜中主要是α-SMA陽性的VSMCs，這些細胞周圍富含以蛋白聚糖為主的ECM。本實驗免疫組化染色的結果表明，A、B、C組血管的中膜上均可見大量α-SMA染色陽性的細胞，而A組內彈力膜外未見α-SMA染色陽性，而B組和C組的新生內膜上均可見α-SMA染色陽性細胞，表明支架置入后平滑肌細胞突破了內彈力膜，遷移至內彈力膜外，同時分泌大量的細胞外基質，導致新生內膜的形成。PCNA在細胞增殖的啟動中起重要作用，是反映細胞增殖狀態的良好指標；檢測其在細胞中的表達，可作為評價細胞增殖狀態的一個指標，且與內膜增生程度有關，是判斷內膜增殖程度的有效指標[16]。本實驗的PCNA免疫組化染色結果表明，A組血管中PCNA表達較少，而B組和C組血管的中膜和內膜上可見PCNA陽性染色，尤其是新生內膜上陽性染色的細胞顆粒較多。對新生內膜中α-SMA和PCNA的陽性染色光密度值的結果分析可見，B組的α-SMA和PCNA光密度值高于C組。相關性分析表明，α-SMA、PCNA與新生內膜厚度呈正相關，表明fasudil可以通過抑制支架置入后平滑肌細胞的遷移和增殖，進而抑制新生內膜的形成和再狹窄的進程，這與既往研究結果一致。

Cat S是木瓜蛋白酶超家族成員，具有較強的彈性纖維和膠原纖維溶解活性。Cat S能降解Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原，層粘連蛋白、纖連蛋白和蛋白聚糖，是木瓜蛋白酶家族中一個強有力的ECM降解半胱氨酸蛋白酶[17]。彈性蛋白是中層ECM蛋白中最主要的蛋白，Cat S能在自然PH值條件下降解彈性蛋白，而彈性蛋白在再狹窄形成過程中ECM的重塑中具有重要的作用。進一步研究[18]發現，Cat S可通過降解ECM促進VSMCs從收縮型轉化為分泌型，提高其增殖和遷移的能力，促進VSMCs從中膜遷移入內膜，從而在新生內膜的形成中發揮重要的作用。既往研究[7，8]表明，在正常血管中Cat S表達較少或幾乎沒有，而在高膽固醇飲食兔和大鼠頸動脈球囊損傷后，血管壁中可見Cat S明顯表達。本實驗RT-RCR檢測結果表明，B組(裸支架組)和C組(裸支架+fasudil組)的Cat S mRNA的表達較A組(假手術組)顯著升高，表明Cat S參與了支架置入后再狹窄形成過程。B組(裸支架組)的Cat S mRNA的表達顯著高于C組(裸支架+fasudil組)，表明fasudil可以降低支架置入后血管中Cat S mRNA的表達。對各指標的相關性分析表明，Cat S mRNA與α-SMA、PCNA、新生內膜厚度之間呈正相關，表明fasudil可能通過降低血管中Cat S mRNA的表達，進而抑制血管平滑肌細胞的遷移和增殖，從而發揮抑制新生內膜的形成和再狹窄進程的作用。

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