血漿及唾液中α-突觸核蛋白作為帕金森病生物學標記物的研究

牛西遠， 吳 蕾， 丁小靈， 趙學軍， 尤和陽

帕金森病(Parkinson disease，PD)是中老年常見的神經系統變性疾病。臨床上以靜止性震顫，運動遲緩，肌強直和姿勢步態異常為主要表現。PD的主要病理改變是是以中腦黑質多巴胺能神經元缺失，黑質殘存神經元內出現路易小體為主要病理改變的神經退行性疾病。路易小體是PD 的重要診斷特征，其包含多種成分，而相關研究表明α-突觸核蛋白是第一個被確認與 PD 相關的蛋白，是路易小體的重要成分之一[1]，α-突觸核蛋白與路易小體的形成及PD的發生密切相關。越來越多的證據α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-Syn)異常聚集是PD病理學級聯反應的關鍵事件。現有的資料表明α-突觸核蛋白異常表達和聚集是PD發病的重要環節。對于PD腦外生物學標記物的研究進展主要集中在血漿、腦脊液、唾液腺等部位[2，3]。既往研究主要集中在腦脊液，取材不便而且影響較大。此外，血漿和唾液較易獲取，傷害較小，使其成為檢測該標記的理想生物標記物。所以此次我們研究集中在血漿和唾液，我們以PD作為研究對象，以年齡匹配的健康者作為對照，比較血漿及唾液中 α-突觸核蛋白有無差異，并比較不同分期、不同病程、疾病進展的PD上述蛋白有無差異，能否成為PD診斷及鑒別診斷、判斷病程、分期的指標。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集2016年1月～2017年6月省立醫院門診或住院的PD患者30例(PD組)，其中男18例，女17例，平均年齡(63.8±7.3)歲，年齡匹配的健康體檢者25例(對照組)，男11例，女14例，平均年齡(64.1±10.8)歲。入選標準：(1)PD組患者符合英國PD腦庫的診斷標準；(2)Hohen Yahr分期1～4期；(3)采集EDTA抗凝血樣；(4)簽署知情意書。對照組為PD患者的健康配偶。排除標準：(1)繼發性帕金森綜合征患者；(2)其他帕金森疊加綜合征患者；(3)符合癡呆診斷標準，臨床癡呆量表評分≥1分；(4)頭部CT或MRI提示腦內器質性病變者；(5)嚴重焦慮、抑郁和精神分裂癥；(6)合并心臟、肺、肝臟、。腎臟、內分泌、血液系統嚴重疾病；(7)患有失語、嚴重構音障礙等影響臨床測評的疾病；(8)受唾液腺和口腔病變者；(9)預計依從性較差。

1.2 方法 本研究使用病例報告表，收集患者的基本信息(姓名、性別、年齡)；疾病情況(發病年齡、病程、疾病進展)。我們從每個PD患者和健康受試者收集最少量的3 ml唾液、血漿。在收集唾液樣本時，受試者需禁食120 min，在前4 h內沒有吸煙，在過去12 h內沒有喝酒。 研究中排除了具有血漿污染的樣品。 通過指示患者將唾液流入無菌試管中，搜集血漿時禁食水12 h，用無菌試管抽取，在4 ℃下以17000 r/min旋轉30 min，收集上清液，轉移至干凈的管中和唾液一起放置-80 ℃下保存。應用統一PD評定量表運動部分評價PD患者運動癥狀，用Hoehn-Yahr分期評估患者疾病受累程度。應用雙抗體夾心法測定標本中人α-突觸核蛋白水平。用純化的人α-突觸核蛋白(α-SYN)抗體包被微孔板，制成固相抗體(中國 博研公司)，往包被單抗的微孔中依次加入α-突觸核蛋白，再與辣根過氧化物酶標記的α-突觸核蛋白抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物 3，3’、5，5’-四甲基聯苯胺(TMB)顯色。 TMB 在辣根過氧化物酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的α-突觸核蛋白呈正相關。用酶標儀在 450 nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標準曲線計算樣品中人α-突觸核蛋白濃度。

2 結 果

2.1 2組各因素比較 PD組血漿及唾液α-突觸核蛋白含量高于對照組(P<0.05)。差異有統計學意義。

2.2 PD血漿及唾液α-突觸核蛋白與各因素的相關性 PD組血漿α-突觸核蛋白含量與病程(r=-0.025，P=0.888)，Hohen Yahr分級(r=-0.163，P=0.348)，年齡(r=020，P=0.908)，統一PD評定量表運動評分(r=-0.159，P=0.362)，發病年齡(r=-0.034，P=0.848)無相關性。

PD組唾液α-突觸核蛋白含量與病程(r=-0.78，P=0.655)，Hohen Yahr分級(r=-0.052，P=0.766)，統一PD評定量表運動評分(r=-0.182，P=0.295)無相關性，與年齡(r=-0.425，P=0.011)，發病年齡(r=-0.336，P=0.048)成負相關。

2.3 ROC曲線分析診斷最佳臨界值 應用血漿α-突觸核蛋白作為PD標記物診斷PD診斷ROC曲線下面積為0.727(P=0.003)，最佳臨界值為157.86 ng/L，敏感性為68.60%，特異性為72.00%。唾液α-突觸核蛋白作為診斷指標，ROC曲線下面積為0.785(P=0.00)，最佳臨界值為211.14 ng/L，敏感性為82.90%，特異性為80.00%。

表1 2組間各因素比較

注：與對照組比較，P<0.05

圖1 唾液α-突觸核蛋白

圖2 血漿α-突觸核蛋白

3 討 論

α-突觸核蛋白為正常人腦組織中一種可溶性蛋白，α-突觸核蛋白在正常生理狀態下并沒有細胞毒性，環境或者基因的改變易引起α-突觸核蛋白發生錯誤折疊，出現寡聚體，纖維性蛋白逐漸增多，繼而形成路易小體，PD的主要病理特征之一是路易小體的出現，其主要成分是α-突觸核蛋白沉積，最終多巴胺神經能細胞程序性死亡使患者出現PD癥狀，隨著檢測技術的提高，在腦積液、血漿、唾液中均可以檢測出α-突觸核蛋白，且發現PD患者體內α-突觸核蛋白較正常對照組存在差異。Duran等[4]研究發現，53例未予治療與42例接受治療的PD患者血漿中α-突觸核蛋白水平相似，均高于對照組，且在該研究中指出在早期疾病的階段α-突觸核蛋白水平的升高，不受抗PD藥物的影響。國內也有研究報道，PD患者血漿中α-突觸核蛋白寡聚體水平明顯高于對照組[5]，唯一描述PD中血漿α-突觸核蛋白水平降低的文獻[6]使用了較前不同的技術，即重組α-突觸核蛋白在大腸桿菌中表達和免疫印跡定量。而與本實驗結果相同的上述幾組實驗均采用ELISA方法，相比上述方法，ELISA法的定量更具體，在比較健康對照組和PD患者之間的血漿α-突觸核蛋白中，更容易量化，結果更線性。雖然有些作者報道說血細胞沒有合成α-突觸核蛋白[6]，但 Barbour等[7]盡管只研究了4個人(健康)，他們仍認為紅細胞可能是血漿α-突觸核蛋白的主要來源。最近的一項研究表明，α-突觸核蛋白通過靜脈注射的形式通過血腦屏障進入中樞神經系統致病，這表明血細胞表達的α-突觸核蛋白在PD發病過程中起潛在作用[8]。PD的病因有老齡化和α-突觸核蛋白，但它們之間的關系也是充滿爭議，我們的研究結果顯示血漿α-突觸核蛋白與年齡無關，與以前的研究一致[7]。Yanamandra等認為神經元的死亡或軸突的損傷突觸末端可導致可溶性的釋放α-突觸核蛋白的聚集形式細胞外，是α-突觸核蛋白生理分泌到細胞外環境的證據[9]。盡管原因不明確，而且我們沒有在其他神經系統疾病中研究α-突觸核蛋白水平。因此我們不能提出血漿α-突觸核蛋白作為特定的生物標志物。本實驗在35個PD患者中檢測到血漿α-突觸核蛋白明顯高于對照組，表明血漿α-突觸核蛋白在PD中仍有它的診斷價值。

相對于血漿、腦脊液等，唾液更具有簡便、經濟、安全無創等優勢[10]，有研究表明頜下腺α-突觸核蛋白病理學檢測對于PD診斷的特異性及敏感性達100%[11]，而頜下腺已被證明參與帕金森病的早期階段[12，13]。既往資料表明人類頜下腺在靜息下產生的唾液占總體積的60%和65%[14]，因此我們選擇唾液中α-突觸核蛋白作為帕金森病診斷的潛在生物標志物是具有前景的領域。本實驗運用ELISA方法分析35例PD患者及25例對照組唾液中α-突觸核蛋白的含量，結果顯示PD患者唾液α-突觸核蛋白明顯低于對照組水平，差異有統計學意義，在本研究中健康受試者與PD之間的年齡無明顯差異。因此，老齡化對唾液決定因素的影響并不偏離本研究獲得的結果。Devic等[15]報道與對照組相比，帕金森病患者唾液α-突觸核蛋白水平明顯降低，此外，該研究發現帕金森病患者唾液α-突觸核蛋白水平與UPDRS(統一帕金森氏病評分量表)運動評分之間的差異，表明其α-突觸核蛋白水平與運動癥狀嚴重程度呈負相關，但效果未達到顯著性，與本實驗一致。且他們證實唾液腺與中樞神經系統相關，并參與帕金森病相對較早的疾病階段[13]，這也解釋了其唾液α-突觸核蛋白與發病年齡和年齡成負相關這一現象[16]，這與本研究一致(r=-0.425，P=0.011)，Al-Nimer等[17]基于20例PD患者也報道唾液中的α-突觸核蛋白水平顯著低于健康受試者，與本實驗一致的是Devic等[15]和Al-Nimer等[17]這兩項研究均針對少數PD患者進行的，這是實驗不足之處，但Vivacqua等[18]在2016報道出在60例PD患者和40例健康受試者相比，PD患者唾液中的α-突觸核蛋白仍減少。這個發現與以前兩次相對較少數據的觀察結果完全一致，相對于上述幾項研究，本實驗更能代表東方人群唾液α-突觸核蛋白特點。神經病理學研究表明，在PD的早期階段，聚集α-突觸核蛋白的細胞主要分布于包括孤束核、迷走神經背核的腦干神經核里[19]，也可能是在上、下唾液核和副交感唾液神經節里面。這提示α-突觸核蛋白可能從唾液神經元的神經元細胞體中擴散出來，沿軸突，到唾液腺上皮細胞周圍的突觸末端，聚集在唾液腺及唾液中[20]。因此，PD患者唾液中檢測到的總α-突觸核蛋白濃度降低可能是由于唾液核或唾液神經節神經元中α-突觸核蛋白的細胞內和軸突聚集，這可能是PD唾液α-突觸核蛋白濃度較正常對照組低的原因。

綜上所述，應用唾液α-突觸核蛋白診斷PD的ROC曲線方面，敏感性、特異性及陽性預測值均比血漿α-突觸核蛋白均高，可更適合作為診斷PD的指標。本研究發現年齡、發病年齡與PD唾液α-突觸核蛋白成負相關，可能與唾液腺萎縮后分泌不足有關，期待以后更多研究證實。

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