酶法輔助提取海紅果中的白藜蘆醇

樊 迎，陳 毅，薛霖莉，連文綺，張 丹

（山西農業大學信息學院，山西太谷030800）

海紅果的學名為西府海棠，又稱海紅子、子母海棠等，屬薔薇科梨亞科蘋果屬[1-2]，具有諸多經濟價值。其果實完全成熟后外觀呈現紫紅色，果肉為淡紅色，果肉脆且多汁，果實比較小，果型近似圓形。

白藜蘆醇的化學名為3，4，5-三羥基二苯乙烯，屬于單寧質多酚，在水中的溶解度較低，易溶于有機溶劑[3]。在自然界中，白藜蘆醇廣泛存在于天然植物或果實中，如葡萄、花生、虎杖、松樹和決明子等[4]。至今，已至少在21科31屬的72種植物中發現有白藜蘆醇[5]。白藜蘆醇是一種天然的抗氧化劑，既具有獨特的生物活性又具有其植物多酚的一部分共性。近年來，國內外諸多學者對其生物學功能進行較深入的研究，結果發現，白藜蘆醇還具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抑制血小板聚集以及調節血脂代謝，保持血液暢通，降低血液黏稠度等廣泛的有益于人類健康的生理藥理學作用[6-9]。丁勇[10]用反相液相色譜法檢測了海紅果酒中白藜蘆醇的含量為144.9 μg/L，但是直接從海紅果中提取白藜蘆醇還未見文獻報道。

本試驗以酶法處理、乙醇提取海紅果干粉中的白藜蘆醇，并進行測定，通過單因素及正交試驗優化，確定其最佳提取條件，旨在為后續相關研究奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

挑選無病蟲害的完整海紅果（產自內蒙古準格爾旗沙圪堵鎮）熟果，將果實清洗干凈，除去果核，放置于陰涼處風干，然后粉碎，在恒溫60℃條件下烘干，過0.42 mm篩后備用。

1.2 試劑與儀器

白藜蘆醇標品（純度＞98%），成都曼斯特生物科技有限公司；纖維素酶（酶活力單位約10000U/g），寧夏和氏璧生物科技有限公司；無水乙醇（分析純），天津市德恩化學試劑有限公司；檸檬酸、檸檬酸鈉（分析純），天津市光復科技發展有限公司。

電熱鼓風干燥箱（GZX-9070MBE，上海博訊實業有限公司）；電子天平（BSA224S，賽多利斯科學儀器有限公司）；酸度計（PHS-25，上海雷磁精密儀器有限公司）；電熱恒溫水箱（SSW-420-2S，上海博訊實業有限公司）；紫外-可見分光光度計（752N，上海精密科學儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 提取和檢測方法[11]準確稱取2.000 g海紅果干粉若干份，置于錐形瓶中。固定初始條件為：溫度50℃，纖維素酶添加量為100mg/g，酶解時間90 min。然后各加入40 mL預先用雙蒸水配制的不同pH值（4.0，4.5，5.0，5.5，6.0）的檸檬酸 - 檸檬酸鈉緩沖溶液、一定量的纖維素酶（60，80，100，120，140mg/g），在一定的酶解溫度（35，40，45，50，55 ℃）下水解一定時間（30，60，90，120，150 min），以考察 pH值、纖維素酶添加量、酶解溫度、酶解時間這4個單因素對白藜蘆醇提取量的影響。酶解完成后，過濾，殘渣各加入60 mL（料液比1∶30）體積分數為80%乙醇溶液作為提取劑，在75℃的恒溫條件下提取4 h，期間保持多次搖晃，使充分接觸。最后，過濾除去雜質取得濾液，用紫外-可見分光光度計在白藜蘆醇的檢測波長306 nm處對濾液進行檢測，得到濾液吸光度值，代入線性回歸方程中進行計算，并求出其含量。每個處理均取3份樣品進行平行操作，結果取平均值。根據單因素試驗結果，選取酶解pH（A）、酶解溫度（B）、酶解時間（C）及纖維素酶添加量（D）4個因素進行4因素3水平（L9（34））正交試驗。

1.3.2 白藜蘆醇含量測定方法[12]將不同質量的白藜蘆醇標準品溶解于體積分數為80%的乙醇溶液，配制成一系列不同濃度的標準溶液，以80%乙醇溶液為參比，于306 nm處測定該系列標液的吸光度值，繪制出標準曲線，得到線性回歸方程為：

其中，Y為吸光度值，ρ為白藜蘆醇標準品的質量濃度（μg/mL）。

2 結果與分析

2.1 纖維素酶法提取白藜蘆醇的單因素試驗結果

2.1.1 酶解pH值對白藜蘆醇產量的影響 由圖1可知，pH值在 4.0～4.5 時，隨著 pH值增加，白藜蘆醇產量急劇升高；當pH值在4.5～5.5時，白藜蘆醇的產量變化不大；且隨著pH值繼續升高，其產量卻略有下降。故選pH值4.5～5.0為合適的酶解條件。

2.1.2 酶解溫度對白藜蘆醇產量的影響 由圖2可知，在酶解溫度為35～50℃時，隨著溫度的升高，白藜蘆醇的產量逐漸增加，當酶解溫度為50℃時，白藜蘆醇的提取產量達到最高；當酶解溫度為55℃時，產量減小，有可能是因為溫度太高破壞了酶的活性。所以，選擇50℃為適宜的酶解溫度。

2.1.3 酶解時間對白藜蘆醇產量的影響 由圖3可知，當酶解時間為30～120 min時，隨著酶解時間的逐漸增加，白藜蘆醇的產量也在升高，當酶解時間為120 min時，白藜蘆醇的產量最高；隨著酶解時間增加為150 min時，白藜蘆醇的產量幾乎不再增加。從節約時間方面考慮，選擇酶解時間120 min為最佳酶解時間。

2.1.4 纖維素酶添加量對白藜蘆醇產量的影響由圖4可知，當纖維素酶添加量為60～120 mg/g時，隨著纖維素酶添加量的增加，白藜蘆醇的產量平穩增長；當纖維素酶的添加量為120 mg/g時，白藜蘆醇產量最高；當纖維素酶添加量增加至140 mg/g時，白藜蘆醇產量反而下降。所以，選擇纖維素酶添加量120 mg/g為適宜的纖維素酶添加量。

2.2 正交試驗結果

據單因素試驗結果，選取酶解pH（A）、酶解溫度（B）、酶解時間（C）及纖維素酶添加量（D）這4個因素進行4因素3水平L9（34）的正交試驗（表1）。其極差分析、方差分析結果分別列于表2，3。

表1 正交試驗的因素及水平

從表2可以看出，比較纖維素酶法提取白藜蘆醇的4個主要影響因素（A，B，C，D）的極差 R值，可得到影響因素的主次排序為：A＞B＞C＞D，即酶解pH（A）的影響最大，其次依次是酶解溫度（B）和酶解時間（C），影響最小的是纖維素酶添加量（D）。經分析，較優組合為 A2B2C2D2，分別是 pH值 4.75、酶解溫度50℃、酶解時間120 min，纖維素酶添加量120 mg/g。

表2 正交試驗優化試驗結果

表3 正交試驗的方差分析結果

由表 3可知，酶解 pH（A）、酶解溫度（B）、酶解時間（C）三者對海紅果干粉中白藜蘆醇提取的影響極顯著（P＜0.01），而纖維素酶添加量（D）的影響達顯著水平（P＜0.05）。

2.3 驗證試驗結果

采用正交優化試驗所得到的最優試驗水平組合A2B2C2D2，并用其進行白藜蘆醇的酶解及提取試驗，平行操作3次，得到白藜蘆醇的含量平均值為114.37 μg/g，與之前的試驗結果吻合良好，說明該工藝條件較為可靠，并具有穩定的再現性。同時，作為對比，也測定了不用纖維素酶處理而直接用料液比1∶30的80%乙醇溶液在75℃條件下提取4 h，得到的平均值為66.32 μg/g。說明用纖維素酶處理破壞了細胞壁，有利于白藜蘆醇在乙醇中的溶出[13]，可明顯提高提取效率，白藜蘆醇的產量是直接用乙醇提取的1.72倍。

3 結論與討論

本研究先采用纖維素酶處理再用乙醇溶液浸提的方法來提取海紅果干粉中的白藜蘆醇，經過單因素與正交試驗的優化，結果發現，pH值4.75、酶解溫度50℃、酶解時間120 min、纖維素酶添加量120 μg/g的條件下，白藜蘆醇的產量最高，可達到114.37 μg/g，是直接用乙醇提取的 1.72 倍，明顯提高了提取效率。

目前，白藜蘆醇的提取主要是以葡萄[14-15]、虎杖[16]、桑葚[17]、花生[18]以及它們的葉、皮、渣、籽等為原料，但是含量均較低（8～192 μg/g），限制了其開發和應用程度。而且隨著國內外食品、生物、日化等領域對白藜蘆醇研究的逐漸深入，市場需求量也在不斷增加，現有產量已經不能滿足不斷增加的需求。因此，從其他植物中提取白藜蘆醇變得至關重要，且具有廣闊的市場前景。本研究所用的酶法輔助乙醇提取海紅果中的白藜蘆醇效果明顯，今后應嘗試將這種方法應用到多種植物白藜蘆醇的提取中。

參考文獻：

［1］趙亮，李青山.海紅果[J].食品與藥品，2007，9（7）：71.

［2］趙福詩，趙麗芹.我國華北地區海紅果生產現狀及發展前景[J].內蒙古農業科技，2008（2）：94.

［3］肖林霞，盧其能，李潤根.白藜蘆醇的研究進展[J].現代農業科技，2015（24）：264.

［4］韓晶晶，劉煒，畢玉平.白藜蘆醇的研究進展[J].生物工程學報，2008，39（2）：93-97.

［5］李潔，熊興耀，曾建國，等.白藜蘆醇的研究進展[J].中國現代中藥，2013，15（2）：100-108.

［6］NDIAYE M，JILIPPE C，MUKHTARH，et al.The grape antioxidant resveratrol for skin disorders:promise,prospects,and challenges[J].Archives of Biochemistry and Biophysis，2011（2）：164-170.

［7］TRINCHERI NF，NICOTRA G，FOLLOC.Resveratrol induces cell death in colorectal cancer cells by a novel pathway involving lysosomal cathepsin D[J].Carcinogenesis，2007，28（5）：922-931.

［8］MEISHIANGJ，LININGC，GEORGE OU，etal.Cancer chemo-preventive activity of resveratrol，anatural product derived from grapes[J].Science，1997（1）：218-220.

［9］ BRANDAMANTE S，BAREGHI L，VILLA A.Cardiovascular protective effects of resveratrol[J].Cardiovase Drug Rew，2014，22（3）：169-188.

［10］丁勇.海紅果酒中白藜蘆醇及其糖苷的檢測方法研究[J].食品研究與開發，2015，36（17）：132-135.

［11］錢時權，石亞中.纖維素酶-超聲波輔助有機溶劑提取山葡萄渣中白藜蘆醇的研究[J].食品工業科技，2012，33（3）：210-213.

［12］蘭天路，朱宏吉，李少白.纖維素酶-微波提取虎杖中白藜蘆醇的工藝[J].化學工業與工程，2008，25（5）：395.

［13］李夢青，聶媛，張潔，等.酶解法提取虎杖中白藜蘆醇、白藜蘆醇苷、大黃素[J].精細化工，2008，25（5）：467-470.

［14］汪開拓，馬莉，盧霞.超聲波輔助提取葡萄皮渣中白藜蘆醇工藝的優化研究[J].西南農業學報，2013，29（3）：1201-1206.

［15］毛俊霞，張文君，李曦墨.響應面優化葡萄葉中白藜蘆醇的提取條件[J].天然產物的研究與開發，2014，26（6）：2027-2032.

［16］劉小麗，張偉，符毅文，等.虎杖中白藜蘆醇的超聲提取及其抗氧化性研究[J].中成藥，2011，33（1）：150-153.

［17］陳瓊玲，薛霖莉，樊迎，等.響應面法優化桑葚果渣中白藜蘆醇的提取功率[J].山西農業科學，2016，44（6）：836-839.

［18］張初署，禹山林，潘麗娟，等.響應面法優化花生根中白藜蘆醇提取工藝研究[J].食品科學，2009，30（6）：467-470.