藜麥營養成分分析及黃酮提取物的抗氧化和抗菌活性研究

李玉英，王玉玲，王轉花

（山西大學生物技術研究所，化學生物學與分子工程教育部重點實驗室，山西太原030006）

藜麥（Chenopodium quinoa）是原產于南美洲安第斯山脈的藜科藜屬植物[1]，是古印加人的傳統糧食作物，種子顏色有白、紅、黑3種色系，具有耐寒、耐旱、耐貧瘠、耐鹽堿等特性，是喜冷涼和高海拔的作物[2-3]。由于生長習性以及對種植條件要求的特殊性，不同環境下生產出的藜麥品質相差極大，目前，其主要分布于南美洲，亞洲的中國山西、青海省及西北地區等。

藜麥營養價值極高，有營養黃金的美稱。藜麥中含有大量優質蛋白，平均為12%～23%[4]，是普通谷物的2倍及以上，可與肉蛋奶媲美，并且含有人體生長必需的所有氨基酸，其中，賴氨酸含量高于大多數谷物。藜麥富含鎂、鋅、鐵、鈣、鉀等多種礦物質，藜麥與常見糧食作物相比，鈣、鐵含量是小麥的4倍。此外，藜麥還含有豐富的膳食纖維[5]、維生素以及包括多酚、皂苷等在內的生物活性成分[6]，其中，黃酮類物質被認為是主要的功能活性成分，不僅具有抗氧化活性[7-8]，還有良好的抑菌活性[9]。RITVA等[10]研究表明，秘魯、西班牙、薩爾塞多等地藜麥的黃酮類含量在 36.2～144.3 mg/100 g；ZHU等[11]從美國托倫斯藜麥種子中分離出了6種黃酮苷元，這6種黃酮苷元在自由基清除試驗中都表現出很強的抗氧化活性。近年來，我國一些學者也開展了對藜麥的研究，孫雪婷等[12]以浙江本土藜麥品種Vanilla為材料，對藜麥總黃酮乙醇浸提法進行優化，結果表明，在最佳條件下黃酮的得率可達2.64 mg/g。

由于藜麥豐富的營養價值，對藜麥中化學成分及生物活性的研究已成為國內外食品研究領域的熱點，我國對于藜麥的研究起步較晚，大多集中在藜麥黃酮提取工藝優化方面，對藜麥黃酮成分鑒定以及抗氧化和抗菌活性的研究甚少。

本研究以山西種植的藜麥種子為材料，利用地方特色資源，采用多種方法分析測定了其中的營養成分，并利用提取獲得的藜麥黃酮化合物進行了抗氧化和抑菌活性研究，旨在評價藜麥的營養價值以及為藜麥中抗氧化物質以及抗菌劑的開發提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

供試黑色（BQ）、紅色（RQ）、白色（WQ）3種藜麥種子采自山西靜樂，系當年收獲種子。

供試菌株金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，BNCC186335），大腸桿菌（Escherichia coli，BNCC337271），枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis，BNCC124990），均由山西大學化學生物學與分子工程教育部重點實驗室保存。

1.2 試劑及儀器設備

1，1- 二 苯 基 -2 三 硝 基 苯 肼（1，1-dipheny1-2-picrylhydrazyl，DPPH）購自美國Sigma公司；蘆丁、槲皮素、山奈酚標品購自北京索萊寶科技有限公司；甲醇、甲酸為色譜純試劑；3，5-二硝基水楊酸（DNS）、無水乙醇、濃硫酸、無水葡萄糖、碳酸鈉、氫氧化鈉、硼酸、硫酸銅和硫酸鉀等其余試劑均為國產分析純。

QE-250高速粉碎機（浙江屹立工貿有限公司）；RE-3000B旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；HN-36B恒溫培養箱（北京市恒諾利興科技有限公司）；HC-2518離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）；Lambda35紫外可見分光光度計（美國Perkin Elmer公司）；Heto PowerDry PL3000真空冷凍干燥器（上海匯分電子科技）；HS800D恒溫水浴鍋 （太倉華利達儀器廠）；Agilent 1260系列高效液相色譜儀（安捷倫有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 藜麥營養成分分析 采用國標方法對山西靜樂藜麥營養成分進行測定，蛋白質測定采用凱氏定氮法（GB 5009.5—2010）；灰分測定采用灼燒法（GB 5009.4—2010）；水分含量測定采用直接干燥法（GB 5009.3—2010）；粗脂肪測定采用索氏抽提法（GB 5009.6—2003）；氨基酸成分委托山西糧食質量檢測中心檢測。

1.3.2 藜麥黃酮的提取制備 其參考文獻[13]，稍有改進。準確稱取5 g干燥粉碎的藜麥樣品，石油醚索氏抽提去脂。以料液比1∶30加入1%HCl-甲醇溶液，在恒溫70℃水浴條件下回流2 h。濾渣重復上述步驟，重復提取一次，合并2次提取液，減壓抽濾，濾液旋轉蒸發至干，殘渣用甲醇定容至5 mL，4℃冰箱中保存備用。

1.3.3 黃酮含量的測定 用甲醇配制蘆丁標準品0.25 mg/mL，用甲醇稀釋標準品質量濃度分別為0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mg/mL，吸取上述標準溶液 5.0 mL，加入到 5 個試管中，分別加 0.3 mL 5%亞硝酸鈉，混勻，室溫下靜置5 min后再加10%硝酸鋁 0.3 mL，混勻，靜置 10 min 后，加入 2 mL 4%氫氧化鈉，然后加水補足到10 mL，混勻后放置10 min，以甲醇為空白對照，510 nm處紫外測定吸光度值，繪制蘆丁標準曲線。取用甲醇稀釋后不同質量濃度的藜麥黃酮提取液重復以上步驟，根據蘆丁標準曲線方程計算不同藜麥樣品中總黃酮的含量。

1.3.4 藜麥黃酮的HPLC-DAD檢測 藜麥黃酮提取液經0.45 μm微孔濾膜過濾后，進樣5 μL進行分析。

用以下色譜條件進行定量分析。色譜柱：Venusil XBP C18（L）（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.4%磷酸，梯度洗脫0～10 min，45%～48%甲醇；10～30 min，48%～52%甲醇；波長為 360 nm；流速為 1.0 mL/min；柱溫為 30 ℃；進樣量為 10 μL。

1.3.5 抗氧化活性測定

1.3.5.1 DPPH自由基清除作用測定 配制 0.05 mg/mL DPPH甲醇溶液，避光放置備用。用甲醇稀釋樣品質量濃度分別為 0.05，0.10，0.15 mg/mL，試管中分別加入不同濃度的樣品溶液2mL，DPPH溶液2mL，充分混勻，在黑暗中避光反應30 min，測定517 nm處的吸光值（A樣品），用甲醇代替DPPH溶液測定吸光值（A對照），用甲醇代替樣品測定吸光值（A空白），以維生素C為陽性對照。試驗平行測定3次，取平均值。按公式（1）計算DPPH自由基的清除率。

1.3.5.2 羥自由基（·OH）清除率的測定 用甲醇稀釋樣品質量濃度分別為 0.05，0.10，0.15 mg/mL，試管中分別加入不同濃度的樣品溶液2 mL，按順序先后加入2 mL 6 mmol/L FeSO4，2 mL 6 mmol/L水楊酸－乙醇，2 mL 6 mmol/L H2O2，充分搖勻后在37℃的水浴鍋中反應30 min，以蒸餾水為參比，于510 nm下測量各濃度的吸光度（D樣品）。用蒸餾水代替水楊酸測得吸光度（D對照），用蒸餾水代替樣品測定吸光度（D空白）。以維生素C作為陽性對照。所有試驗均平行測定3次，取平均值，按公式（2）計算·OH清除率。

1.3.5.3 總還原力的測定 試管中依次加入1 mL不同濃度提取溶液，2.5 mL 0.2 mol/L PBS 磷酸緩沖液（pH值6.6），2.5 mL 1.0%K3（Fe（CN）6）混合置于50℃的水浴鍋中反應20 min，加入2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，搖勻，將混合物以3 000 r/min離心10 min。吸取2.5 mL上清液，加2.5 mL雙蒸水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵，混勻，測定樣品在 700 nm波長處的吸光度值。以維生素C作為陽性對照。結果重復測定3次，取平均值。

1.3.6 抗菌活性測定 依據上述3個樣品黃酮含量和抗氧化活性測定結果，選取黃酮含量和抗氧化活性都較高的BQ樣品進行抑細菌活性測定。取供試的大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌菌株進行活化，加入無菌水中，制成菌懸液，借助麥氏比濁儀調制菌濃度為107cfu/mL。采用牛津杯法測黃酮提取物的抑菌活性。采用甲醇稀釋黃酮貯備液質量濃度分別為16，8，4 mg/mL。無菌條件下，在培養皿中注入20 mL培養基，取0.18 mL菌懸液均勻涂布于其上，將滅菌的牛津杯均勻置于平板上，然后加入0.2 mL樣液，于培養箱中培養24～28 h。用甲醇作為陰性對照，采用精確度為1 mm的游標卡尺量取抑菌圈直徑，肉眼觀察無明顯細菌生長的區域作為抑菌圈邊緣，試驗抑菌圈直徑為減去對照組后的值，結果平行測定3次。

1.4 數據處理

所有試驗均重復測定3次，采用SPSS 17.0統計分析軟件對數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 藜麥營養成分分析

表1 藜麥基本營養成分分析

表2 藜麥氨基酸組成分析 g/100 g

由表1可知，藜麥中蛋白質含量平均為12.98%，其中，WQ為 11.81%，RQ為 13.74%，BQ為 13.39%，相比于其他谷類作物大麥（11%）、水稻（7.5%），其蛋白質含量較高，與玉米（13.4%）相當[14-15]。藜麥中的淀粉含量在57.08%～63.37%，與其他谷物水稻（70%～80%）、玉米（65%～72%）相比，藜麥中的淀粉含量稍低。3種藜麥的水分、灰分、脂肪含量差異不大。不同顏色藜麥黃酮含量差異較大，顏色越深含量越高，最大為 3.35 mg/g。

本試驗對17種氨基酸進行了檢測，從表2可以看出，3種藜麥的氨基酸組成的類型相差不大，但氨基酸相對含量有一定的差異。其中，BQ的氨基酸總量最高，平均為12.53 g/100 g。測定結果也顯示，藜麥中富含賴氨酸（0.25～0.35 g/100 g）、亮氨酸（1.48～1.82 g/100 g）、蛋氨酸（0.12～0.16 g/100 g）等人體生長所需的必需氨基酸。

2.2 HPLC分析藜麥黃酮的成分及含量

表3 藜麥中黃酮化合物的含量 mg/100 g

用高效液相色譜法測定藜麥種子中提取的黃酮類化合物。HPLC的分析測定結果如圖1所示，其中，（1），（2），（3），（7） 為槲皮素，（4），（5），（6），（8）為山奈酚，都是藜麥種子黃酮的主要成分。

根據HPLC的分析測定結果，繪制標準曲線，得出2種標品中黃酮的回歸方程。其中，槲皮素標準曲線回歸方程為 y＝ 40.028x＋4.308 7 （R2＝0.996 19）；山奈酚標準曲線回歸方程為 y＝35.649x＋3.067（R2＝0.993 6）。根據以上標準曲線回歸方程計算黃酮含量，結果列于表3，藜麥中槲皮素和山奈酚的含量分別為 15.06～35.25，15.56～20.46 mg/100 g。其中，RQ樣品中槲皮素含量明顯高于其他2個樣品。RITVA等[10]研究表明，不同品種藜麥的黃酮類含量在 36.2～144.3 mg/100 g；HIROSE等[16]利用高效液相色譜分析了4種藜麥黃酮苷，結果表明，日本藜麥種子黃酮的含量高于南美藜麥和日本的蕎麥，而大部分谷物類如水稻、小麥、玉米都不含有黃酮類物質。

2.3 藜麥黃酮提取物的抗氧化活性

以Vc為陽性對照，采用3種常用的體外抗氧化活性方法（DPPH自由基清除法、羥自由基（·OH）清除法和總還原力法）對藜麥黃酮的抗氧化活性進行了測定，結果如圖2所示。

由圖2可知，3種不同顏色藜麥黃酮提取物均具有明顯的抗氧化活性，清除DPPH的IC50值（半抑制濃度）分別為 0.08，0.09，0.14 mg/mL，清除·OH的 IC50值分別為 0.08，0.10，0.15 mg/mL，BQ 和 RQ樣品清除自由基的能力強于WQ，表明顏色越深，其清除自由基的能力越強。還原力測定結果表明，3種樣品藜麥黃酮在試驗質量濃度（0.05～0.15 mg/mL）范圍內總還原力與質量濃度呈線性關系，說明其具有較強的還原能力，與Vc相比，清除率略低。這一結果與上述黃酮含量測定結果也具有一定程度的一致性，整體呈正相關趨勢，表明藜麥中黃酮某些成分具有清除氧自由基抗氧化的作用。

2.4 藜麥黃酮提取物對供試菌株的抑菌效果

藜麥黃酮對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌抑菌作用通過牛津杯法進行了檢測。由圖3可知，藜麥黃酮對各供試菌株均表現出明顯的抑制作用，最大抑菌圈直徑分別為22，24，23 mm，隨著黃酮質量濃度的增大，抑菌范圍也逐漸增大，對大腸桿菌抑制效果最為明顯。

3 討論

已有研究表明，不同產地、生態環境、栽培條件會影響藜麥種子營養成分及其抑菌性、抗氧化活性。山西省靜樂縣作為我國最大的藜麥種植生產縣，與種植地方小雜糧相比具有比較高的競爭優勢。本研究以3種山西靜樂藜麥種子為材料，營養成分測定結果表明，其蛋白質、脂肪、氨基酸含量稍有差異，但均高于小麥、水稻等傳統糧食作物。WRIGHT等[17]研究表明，玻利維亞的甜藜麥和苦藜麥蛋白質含量分別為14.8%和15.7%，與本試驗測得的結果稍有不同，可能是由于不同基因型、生長環境以及檢測方法導致了不同產地藜麥中蛋白質的差異，高海拔有利于藜麥蛋白質品質的提高。

藜麥中含有豐富的黃酮。許多研究表明，藜麥中黃酮和植物甾醇類物質具有很強的抗氧化能力。ADBERRAHIM等[18]對秘魯13種有色藜麥進行了研究，結果表明，秘魯藜麥種子是酚類和黃酮類物質的良好來源，并且抗氧化能力高于一般谷物，不同植物品種間黃酮化合物的含量差異很大[19-20]。本研究表明，山西靜樂3種藜麥中深色種子有更高黃酮含量和抗氧化活性，而常見谷物小麥、燕麥、大麥等谷物中幾乎不含有黃酮類化合物。由此可見，深色藜麥可作為一種很好的天然抗氧化劑的來源。已有研究表明，黃酮化合物具有抗真菌、抗細菌活性，本研究也發現，藜麥黃酮提取物對供試菌種大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均有明顯的抑制作用，但其抑菌活性成分還需進一步研究。本研究結果對于藜麥作為山西地標特色農產品的推廣種植具有一定的促進作用，也可為我國藜麥資源的功能開發與應用提供一定的參考。

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