不同N-甲基-N-亞硝基脲處理下高粱離體花粉的活力解析

岑慧慧 ，田承華 ，程慶軍 ，屈雅娟 ，牛鵬飛 ，李 楠，岳忠孝 ，李 菁 ，崔桂梅 ，田懷東 ，4

（1.山西大學生命科學學院，山西太原030006；2.山西省農業科學院高粱研究所，山西晉中030600；3.山西省農業科學院生物技術研究中心，山西太原030031；4.山西景康農業技術推廣有限公司，山西壽陽045400）

高粱作為主要糧食作物之一，在農業、食品、飼料、能源、釀造、醫藥等諸多領域被廣泛利用，是支撐經濟社會發展的重要資源。然而，隨著在高粱品種培育、推廣及其生產活動中，人們對育種材料、品種與栽培環境的選擇性制約，高粱在育種研究中面臨著多樣性弱化和生存環境惡化的局面。因此，開發有效的誘變育種技術，解決當前高粱面臨的問題是作物育種的任務之一。

人工誘變是作物種質創新的有效途徑，主要包括物理誘變、生物誘變與化學誘變[1-2]。其中，化學誘變是用烷化劑等化學誘變劑處理作物的器官、組織、細胞，誘發突變體的方法，其具有操作簡單、低成本、高基因誘變率等優點。國內外主要使用EMS處理種子等器官進行高粱誘變，已獲得了一些植株和籽粒性狀的突變體[3-7]。然而，由于EMS是一種有機溶劑，對種子的滲透性較差，并且處理種子容易產生嵌合體，誘變效率較低。截至目前，高粱突變體的利用研究促進了少數高粱基因的分子鑒定與功能解析[8-15]，然而，絕大多數高粱基因的生物學功能仍然是未知的。為了滿足后基因組時代高粱基因組學與育種研究對大量基因突變材料的需求，有必要開發高效的高粱基因化學誘變技術。

MNU是一種水溶性的高效基因化學誘變劑，在一些哺乳動物與微生物誘變研究中已被證明可以通過作用于核酸底物，使得堿基甲基化，進而引起GC轉變成AT[16-17]。

本研究采用TTC染色法，研究了不同MNU誘變因素對高粱離體花粉活力的影響，旨在為高粱基因高效誘變技術的開發提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 供試材料和試劑

供試高粱自交系M02-16種植于山西省高粱研究所試驗基地，在高粱開花期，每天8：00—9：00，收集適量花粉于硫酸紙袋，迅速帶回實驗室過篩，將過篩后的花粉放在培養皿中置于冰箱，干燥狀態下4℃保存。MNU由上海阿拉丁生化科技股份有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 單因素試驗 參照李珍等[18]的方法，配制含有50%（W/V）甘油、15%乙二醇、15%二甲基亞砜、0.4%蔗糖的最優保護液體系（PSS1）。將花粉置于PSS1保護液中用于單因素以及正交試驗。

1.2.1.1MNU濃度對花粉活力的影響 MNU濃度設計 5 個水平：0.1，0.5，1.0，1.5，2.0 mmol/L。將備用花粉平均分成5份，分別加入不同濃度水平的MNU，室溫下避光處理40 min。采用TTC法對處理后的花粉活力進行測定，記錄數據。

1.2.1.2 處理時間對花粉活力的影響 將一定量的備用花粉加入到1.0 mmol/L的MNU溶液中，室溫下分別避光處理 20，40，60，80，100 min，測定花粉活力。

1.2.1.3 磷酸緩沖液pH對花粉活力的影響 取等量的花粉分別放置于5個培養皿中，將1.0 mmol/L的MNU溶液分別加入培養皿中，將其pH值分別調到 4.2，4.5，4.8，5.1，5.4，室溫下避光處理 40 min。測定花粉活力，記錄數據。

1.2.1.4 磷酸鹽濃度對花粉活力的影響 磷酸鹽濃度設計 5 個水平：5，10，15，20，25 mmol/L。各濃度緩沖液取10 ml，分別加入 1.0 g MNU，分別加入等量的花粉，室溫下避光處理40 min。測定花粉活力，記錄數據。

1.2.2 正交試驗 由于各因素之間存在交互作用，因此，有必要設計正交試驗以確定最佳高粱離體花粉誘變組合。本試驗在單因素結果的基礎上，依據正交助手設計了正交試驗（表1）。

表1 MNU誘變高粱離體花粉各因素正交試驗設計 L9（34）

1.3 高粱離體花粉活力的測定方法

試驗采用TTC法測定花粉活力，其主要原理是有活力的花粉呼吸作用產生的NADH2或NADPH2可將無色氯化三苯基四氮唑還原為紅色的三苯基甲（TTF）。因此，有活力的花粉被染成紅色，無色的花粉即為沒有活力或是活力較低的花粉。

2 結果與分析

2.1 MNU處理各因素對高粱離體花粉活力的影響

表2～5分別顯示了在其他因素水平為定值的前提下，MNU濃度、處理時間、磷酸鹽濃度以及pH值的變化對受處理離體花粉活力的影響。由表2，3可知，受處理花粉的存活率隨MNU濃度的增大與處理時間的延長呈現逐漸下降的趨勢；其下降速率在 MNU0.5～1.5 mmol/L、處理時間 20～60 min 的范圍內相對平緩，當MNU濃度大于1.5 mmol/L、時間大于60 min時下降速率明顯增大。

表3 MNU處理時間對高粱離體花粉活力的影響

從表4可以看出，受處理花粉存活率在pH值4.2～4.8范圍內，隨 pH的增大呈上升趨勢，當 pH值為4.8時達到最高，當pH值大于4.8時，又呈下降趨勢。

表4 MNU處理液的pH值對高粱離體花粉活力的影響

由表5可知，受處理離體花粉的存活率，隨磷酸鹽濃度的增加呈現先上升后下降的變化趨勢，在磷酸鹽濃度為10 mmol/L時達到最大，磷酸鹽濃度大于10 mmol/L開始急速減小。總體而言，MNU濃度為 0.5～1.5 mmol/L、處理時間為 20～60 min、pH值為 4.8～5.1、磷酸鹽濃度為 5～15 mmol/L 為保持受處理花粉較高活力的適宜條件。

表5 MNU處理液中磷酸鹽濃度對高粱離體花粉活力的影響

2.2 MNU處理對高粱離體花粉活力的多因素效應

根據MNU處理單因素對受處理花粉活力的影響，取各因素可保持較高花粉活力的3個水平，進行了多因素正交試驗（表6）。

表6 MNU誘變處理對高粱離體花粉活力影響的正交試驗結果

多因素效應分析結果表明，MNU處理因素影響離體花粉活力的大小順序為MNU濃度＞處理時間＞磷酸鹽濃度＞pH值，保持最高花粉活力的最優條件組合為MNU濃度0.5 mmol/L、處理時間40 min、pH值 4.8、磷酸鹽濃度 10 mmol/L（表 7）。

表7 MNU處理對高粱離體花粉活力的多因素效應

顯微觀察視野下，與磷酸鹽緩沖液處理后相比，最優條件下處理后花粉的脹破現象顯著減少，其TTC染色活力狀態明顯改善（圖1）。

3 結論與討論

基于哺乳動物和微生物細胞MNU處理的誘變表明，MNU作為一種水溶性誘變劑，不僅有高效的基因誘變效應，對微生物體細胞也具有強烈的致癌致死作用[16-17]。通過研究PSS1保護下系列MNU緩沖液處理對高粱離體花粉活力的影響，旨在從影響受處理花粉存活率的諸因素（MNU濃度、處理時間、pH值、磷酸鹽濃度）中探求可維持花粉較高活力的適宜條件，以解決MNU誘變處理高粱離體花粉時，花粉極易死亡的問題。在設計水平范圍內，受處理高粱花粉的存活率與MNU濃度和處理時間呈負相關，且當MNU濃度大于1.5 mmol/L、處理時間大于60 min時，其存活率下降速率急劇增大，1.5 mmol/L的MNU和60 min的處理時間是高粱花粉細胞忍耐MNU毒性作用的極端敏感條件。高等植物花粉細胞的活力隨所處環境pH值波動而變化，起因于H+濃度對花粉結構及其內部酶活性的影響；隨所處溶液環境鹽離子濃度的改變而變化，起因于環境離子對其滲透壓、代謝與形態的影響[19-21]。在設計水平范圍內，受處理高粱花粉的存活率，隨MNU處理液的pH值與磷酸鹽濃度的增大呈先增大后降低的變化規律，當pH值與磷酸鹽濃度范圍分別為4.8～5.1與5～15 mmol/L時，可維持相對穩定的較高水平，MNU處理液pH值為4.8～5.1與磷酸鹽濃度為5～15 mmol/L是高粱花粉細胞可拮抗H+與鹽離子影響的適宜水平。MNU處理對高粱離體花粉活力的多因素效應分析結果顯示，保持受處理花粉最高活力的最優條件是MNU濃度0.5 mmol/L、處理時間 20 min、磷酸鹽濃度 10 mmol/L、pH值 4.8。本研究確立了用MNU緩沖液處理高粱離體花粉的適宜條件與最優條件，解決了高粱花粉生殖細胞基因MNU誘變技術開發的難題。

參考文獻：

［1］ DAVIES D R，WALL E T.Artificial mutagenesis in plant breeding[J].Nature，1958，182：955-956.

［2］KONZAK C F，NILANRA，KLEINHOFS A.Artifical mutagenesis as an aid in overcoming genetic vulnerability of crop plants[J].Basic Life SCI，1976（8）：163-177.

［3］ WANG C，ZHU Z，LI D，et al.EMS mutagenesis,mutant screening and identification of sorghum[J].Biotechnology Bulletin，2014（9）：78-83.

［4］SREERAMULUK.Chemical mutagenesis in sorghum[J].Proceedings of the Indian Academy of Sciences-Section B，1971，74（4）：161-173.

［5］RAMULUK S.Sensitivity and induction of mutations in sorghum[J].Mutation Research-Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis，1970，10（3）：197-206.

［6］王春語，朱振興，李丹.高梁EMS誘變及突變體篩選、鑒定[J].生物技術通報，2014（9）：78-83.

［7］ SREE R K.Mutagenicity of radiations and chemical mutagens in sorghum[J].Theoretical&Applied Genetics，1970，40（6）：257.

［8］BOUTS，VERMERRIS WA.Candidate-gene approach toclone the sorghum brown midrib gene encoding caffeic acid o-methyltransferase[J].Molecular Genetics&Genomics，2003，269（2）：205-214.

［9］ SETHC M，ARUN S，WILLIAML R，et al.Genetic improvement of sorghumas a biofuel feedstock.I.QTL for stemsugar and grain nonstructural carbohydrates[J].Crop Science，2008，48（6）：2165-2179.

［10］ BUROW G B，FRANKS C D，ACOSTAMARTINEZ V，et al.Molecular mapping and characterization of blmc,a locus for profuse wax （bloom）and enhanced cuticular features of sorghum[J].Theoretical&Applied Genetics，2009，118（3）：423-431.

［11］ HART G E，SCHERTZ K F，PENG Y，et al.Genetic mapping of sorghum bicolor（l.）moench qtls that control variation in tillering and other morphological characters[J].Theoretical&Applied Genetics，2011，103（8）：1232-1242.

［12］UPADHYAYA HD，WANG Y H，SHARMA S，et al.SSRmarkers linked to kernel weight and tiller number in sorghum identified by association mapping[J].Euphytica，2012，187（3）：401-410.

［13］BROWNP J，ROONEY WL，FRANKS C，et al.Efficient mapping of plant height quantitative trait loci in a sorghum association population with introgressed dwarfing genes[J].Genetics，2008，180（1）：629.

［14］KAWAHIGASHI H，KASUGA S，SAWADA Y，et al.The sorghum gene for leaf color changes upon wounding（P）encodes a flavanone 4-reductase in the 3-deoxyanthocyanidin biosynthesis pathway[J].G3 Genesgenetics，2016，6（5）：1439-1447.

［15］ BUROW G，FRANKS C，XINZ，et al.Developmental and genetic characterization of a short leaf mutant of sorghum（Sorghum bicolor L.（Moench）[J].Plant Growth Regulation，2013，71（3）：271-280.

［16］NEALE S.Mutagenicity of nitrosamides and nitrosamidines in micro-organisms and plants[J].Mutat Res，1976，32（3）：229-266.

［17］SWAINCG，SCOTTCB.Quantitative correlation of relative rates.comparison of hydroxide ion with other nucleophilic reagents toward alkyl halides,esters,epoxides and acyl halides[J].Ame Chem Soc，1953，75（1）：141-147.

［18］李珍，田承華，趙寧，等.玻璃化保護液處理下高粱離體花粉的活力解析[J].山西農業科學，2016，44（4）：463-466.

［19］LUY，CHANROJ S，ZULKIFLI L，et al.Pollen tubes lacking a pair of K+transporters fail totarget ovules in Arabidopsis[J].Plant Cell，2011，23（1）：81-93.

［20］梁海曼，方國偉.不同pH值緩沖液中蠶豆花藥小孢子的有絲分裂狀況[J].植物生理學報，1984（2）：19-21，62.

［21］張峰，王蒂，王玉萍.馬鈴薯成熟花粉原生質體分離[J].中國農業科學，2004，37（9）：1358-1362.