水稻GPH3突變體胚乳貯藏蛋白質(zhì)蓄積狀態(tài)的解析

屈雅娟，王益華，岑慧慧，牛鵬飛，郭艷萍，姜建芳，田懷東

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇南京210095）

水稻是主要的糧食作物。水稻胚乳蓄積可溶于稀酸的谷蛋白、醇溶蛋白以及可溶于中性鹽溶液的球蛋白。它們作為貯藏蛋白，為種子發(fā)芽及幼苗生長提供代謝用氨基酸，也是食用稻米動(dòng)物與人群的重要氨基酸源。其中，谷蛋白和醇溶蛋白是主要的稻米貯藏蛋白，分別占種子總蛋白含量的60%～75%和18%～25%[1-3]，對(duì)稻米蛋白質(zhì)的營養(yǎng)品質(zhì)起著決定性作用。

在發(fā)育的野生型水稻胚乳細(xì)胞中，醇溶蛋白和谷蛋白在糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（RER）分別由各自多基因家族的mRNA編碼合成后，經(jīng)過不同的亞細(xì)胞區(qū)室化過程，蓄積成不同形態(tài)的蛋白體（PB）[4-5]。水稻醇溶蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被合成后蓄積成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)衍生的球狀蛋白體（PBⅠ）。水稻谷蛋白以57 ku谷蛋白前體在糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（RER）中合成后，被輸送到液泡，并最終以成熟型的約40 ku酸性組分與20 ku堿性組分蓄積成不規(guī)則的液泡型蛋白體（PBⅡ）[4-5]。闡明貯藏蛋白合成蓄積的遺傳調(diào)控機(jī)制對(duì)于改善水稻蛋白質(zhì)營養(yǎng)品質(zhì)的育種研究具有重要意義。

57 ku谷蛋白前體高量增加的57H突變體是研究水稻貯藏蛋白合成蓄積的有用素材。截至目前，導(dǎo)致成熟型谷蛋白顯著減少的4個(gè)隱性57H變異已被表明是關(guān)于谷蛋白蓄積的基因突變[6-11]。山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院種質(zhì)資源遺傳實(shí)驗(yàn)室從410份來源不同的水稻種質(zhì)中發(fā)掘出3個(gè)新型的57H突變體，命名為“GPH系列”。該系列具有57 ku谷蛋白前體大量增加、成熟型谷蛋白未減少的新型性狀[12]。其中，GPH1與GPH2兼具13 ku醇溶蛋白缺失的新型性狀，而GPH3的醇溶蛋白無變化性狀。

本研究以正常型水稻遼鹽6號(hào)作為對(duì)照材料，對(duì) GPH3突變體進(jìn)行了 SDS-PAGE，Western blot，透射電鏡觀察蛋白體亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)等試驗(yàn)，旨在對(duì)GPH3突變體水稻胚乳蛋白的蓄積狀態(tài)進(jìn)行研究分析，從而得出突變基因?qū)ι膳呷橘A藏蛋白過程及其對(duì)貯藏蛋白蓄積狀態(tài)產(chǎn)生的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為正常型水稻品種（遼鹽6號(hào)）與GPH3突變體籽粒。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 SDS-PAGE 參照 TIAN等[7]的方法，將上述供試材料成熟種子的粉末加入提取液（0.125 mol/L Tris-HCl，5% β-巰基乙醇，4%SDS，4 mol/L尿素，5 mmol/L EDTA，2 mol/L PMSF，pH 值 6.8）中，充分提取分離種子蛋白；將所得蛋白用于SDS-PAGE。

1.2.2 Western blot 參照 YAMASHITA 等[13]報(bào)道的方法，在上述SDS-PAGE結(jié)束后，凝膠不經(jīng)染色，將分離的蛋白轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜上，進(jìn)行抗20 ku谷蛋白堿性組分抗體的免疫反應(yīng)；使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)免疫信號(hào)，使用Tanon MP軟件觀察結(jié)果。

1.2.3 基于電子染色的透射電鏡觀察 橫切（厚度1～2 mm）開花后12 d的種子，將所得樣品置于2.5%戊二醛溶液中固定，在0.1 mol/L磷酸緩沖液（PBS，pH值7.2）中4℃下避光保存。對(duì)清洗后的樣品在1.5%四氧化鋨溶液中2 h，4℃下進(jìn)行后固定。梯度乙醇中脫水后在樹脂中滲透。切片后置于鎳網(wǎng)上醋酸雙氧鈾及檸檬酸染色，并用透射電鏡觀察。

1.2.4 基于免疫膠體金標(biāo)記的透射電鏡觀察 將經(jīng)固定但不后固定的樣品，用LR-White樹脂包埋。在切片機(jī)上修整樣品塊，并制備成50～90 nm厚的切片。在鎳網(wǎng)上，對(duì)所得切片使用3%BSA-PBS封閉20 min后，加入一抗（稀釋倍數(shù)1∶200）、室溫靜置2 h，去除液體并用1%的BSA-PBS清洗3次后加入金標(biāo)二抗（稀釋倍數(shù)1∶100）、室溫靜置1 h，后用ddH2O清洗并用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色后在透射電鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 GPH3突變體胚乳蛋白體的亞細(xì)胞形態(tài)學(xué)解析

與正常型水稻品種（遼鹽6號(hào)）相比，GPH3突變體具有色白、粉質(zhì)的胚乳性狀（圖1），胚乳貯藏蛋白的SDS-PAGE解析及基于抗20 ku谷蛋白堿性組分抗體標(biāo)記的Western blot分析顯示，GPH3大量增加了57 ku谷蛋白前體，但并未影響對(duì)其他貯藏蛋白的性狀（圖2-A，B）。

將遼鹽6號(hào)與GPH3突變體的開花后12 d的種子橫切試樣用于基于電子染色的超薄切片制備與處理，將所得切片用于透射電鏡觀察（圖3）。與已報(bào)道的野生型水稻品種一致，遼鹽6號(hào)的胚乳細(xì)胞蓄積了電子染色較淺的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)衍生型球狀蛋白體（PBⅠ）與染色較深的液泡型不規(guī)則蛋白體（PBⅡ（圖3-A）；而在GPH3胚乳細(xì)胞中，除了PBⅠ與PBⅡ外，還出現(xiàn)了由不同染色程度蛋白顆粒組成的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)衍生型的復(fù)合蛋白體結(jié)構(gòu)（圖3-B）。這些結(jié)果表明，GPH3胚乳細(xì)胞中變異型蛋白體結(jié)構(gòu)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)位置生成。

2.2 GPH3胚乳貯藏蛋白體的蛋白構(gòu)成解析

將遼鹽6號(hào)與GPH3突變體的開花后12 d的種子橫切試樣用于基于抗谷蛋白抗體免疫金顆粒（6 nm）與醇溶蛋白抗體免疫金顆粒（15 nm）標(biāo)記的超薄切片制備與免疫處理，將處理后的切片用于透射電鏡觀察（圖4）。與已報(bào)道的野生型水稻品種一致，遼鹽6號(hào)胚乳細(xì)胞PBⅠ中蓄積了醇溶蛋白，PBⅡ中蓄積了谷蛋白（圖4-A）；而在GPH3胚乳細(xì)胞中，生成了由醇溶蛋白抗體標(biāo)記的蛋白顆粒與分布于其表面的谷蛋白抗體標(biāo)記的蛋白顆粒構(gòu)成的復(fù)合蛋白體結(jié)構(gòu)（圖4-B）。由于在水稻胚乳細(xì)胞中成熟型谷蛋白經(jīng)由谷蛋白前體內(nèi)切生成并最終蓄積成PBⅡ，所以，判定GPH3變異型復(fù)合蛋白體結(jié)構(gòu)中的谷蛋白是谷蛋白前體。

3 結(jié)論與討論

在發(fā)育的水稻胚乳細(xì)胞中，醇溶蛋白與谷蛋白在糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分別由各自的多基因家族的mRNA編碼合成后，經(jīng)過不同亞細(xì)胞途徑，以不同的蛋白體（PB）形態(tài)被蓄積起來[1]。通過細(xì)胞骨架，醇溶蛋白的mRNA主要被定位在PB-ER上，而谷蛋白的mRNA主要被定位在C-ER上[14-18]。13～14 ku醇溶蛋白是主要的醇溶蛋白，由7～9條多肽鏈組成；它們被編碼合成后，經(jīng)過肽鏈的裝配與濃縮，被沉積成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)衍生的PBⅠ[19-21]。

胚乳蛋白體的亞細(xì)胞形態(tài)學(xué)及其免疫細(xì)胞化學(xué)解析顯示，GPH3突變體胚乳細(xì)胞中野生型蛋白體的正常形成以及由醇溶蛋白顆粒與谷蛋白前體顆粒構(gòu)成的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)衍生型復(fù)合蛋白體結(jié)構(gòu)生成。這些結(jié)果說明，GPH3變異并非調(diào)控貯藏蛋白質(zhì)翻譯后蓄積的基因突變，可能與貯藏蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的合成有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：

［1］OKITA TW，ROGERS J C.Compartmentation of proteins in the endomembrane systemof plant cell[J].Asnnual Reviewof Plant Physiology&Plant Molecular Biology，1996，47：327.

［2］李宗智，婁希祉.我國主要糧食作物品質(zhì)育種進(jìn)展[J].河北農(nóng)學(xué)報(bào)，1985，10（3）：11-16.

［3］黃英金，劉宜柏.不同類型水稻品種的稻米蛋白質(zhì)含量及其氨基酸組成的研究[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1989（2）：25-31.

［4］王偉權(quán)，楊翠平，王景雪，等.水稻谷蛋白GluB-4基因啟動(dòng)子克隆及載體構(gòu)建[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2007，22（2）：22-25.

［5］SARKERS C，OGAWA M，TAKAHASHI M，et al.The processing of a 57-kDa precursor peptide tosubunits of rice glutelin[J].Plant Cell Physiol，1986，27（8）：1579-1586.

［6］TAKEMOTOY，COUGHLANS J，OKITA TW，et al.The rice mutant esp2 greatly accumulates the glutelin precursor and deletes the protein disulfide isomerase [J].Plant Physiol，2002，128（4）：1212-1222.

［7］ TIAN H D，SATOH H，TAKEMOTO Y.Inheritance of novel 57H mutations in rice and their effect on compartmentation of endosperm storage proteins[J].INTJ Plant SCI，2004，165（4）：537-544.

［8］WANGY，ZHUS，LIUS，et al.The vacuolar processing enzyme Os-VPE1 is required for efficient glutelin processing in rice[J].Plant J，2009，58（4）：606-617.

［9］WANG Y，RENY，LIUX，et al.OsRab5a regulates endomembrane organization and storage protein trafficking in rice endosperm cells[J].Plant J，2010，64（5）：812-824.

［10］FUKUDA M，SATOH-CRUZM，WENL，et al.The small GTPase Rab5a is essential for intracellular transport of proglutelin from the Golgi apparatus tothe protein storage vacuole and endosomal membrane organization in developing rice endosperm[J].Plant Physiol，2011，157（2）：632-644.

［11］ FUKUDA M，WEN L，SATOH-CRUZ M，et al.A guanine nucleotide exchange factor for Rab5 proteins is essential for intracellular transport of the proglutelin from the Golgi apparatus to the protein storage vacuole in rice endosperm [J].Plant Physiol，2013，162（2）：663.

［12］車倩倩，郭艷萍，李強(qiáng)，等.新型水稻57H突變體的發(fā)掘與表征[J].作物學(xué)報(bào)，2013，39（6）：1054-1059.

［13］ YAMASHITA A，NIJO N，POSPíSIL P，et al.Quality control of photosystem II：reactive oxygen species are responsible for the damage to photo-system II under moderate heat stress[J].J Biol Chem，2008，283（42）：28380.

［14］LI X，F(xiàn)RANCESCHI V R，OKITA TW.Segregation of storage protein mRNAs on the rough endoplasmic reticulummembranes of rice endospermcells[J].Cell，1993，72（6）：869-879.

［15］WUY，MUENCH D G，KIMY T，et al.Identification of polypeptides associated with an enriched cytoskeleton-protein body fraction from developing rice endosperm[J].Plant&Cell Physiol，1998，39（12）：1251.

［16］MUENCH D G，CHUONG S D，F(xiàn)RANCESCHI V R，et al.Developing prolamine protein bodies are associated with the cortical cytoskeleton in rice endosperm cells[J].Planta，2000，211（2）：227-238.

［17］ CHOI S B，WANG C，MUENCH D G，et al.Messenger RNA targeting of rice seed storage proteins to specific ER subdomains[J].Nature，2000，407：765-767.

［18］CROFTS A J，CROFTS N，WHITELEGGE J P，et al.Isolation and identification of cytoskeleton-associated prolamine mRNA binding proteins from developing rice seeds[J].Planta，2010，231（6）：1261.

［19］ KRISHNAN H B，F(xiàn)RANCESCHI V R，OKITA T W.Immunochemical studies on the role of the Golgi complex in protein-body formation in rice seeds[J].Planta，1986，169（4）：471-480.

［20］王艷平，田孟祥，湯陵華，等.水稻57H谷蛋白突變體的谷蛋白含量分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（6）：34-35.

［21］韓寶達(dá)，李立新.植物種子貯藏蛋白質(zhì)及其細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)與加工[J].植物學(xué)報(bào)，2010，45（4）：492-505.