MR淋巴造影顯影兔VX2乳腺癌模型內(nèi)乳前哨淋巴結(jié)

王攀鴿，譚紅娜，王 博，肖慧娟，高劍波

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院放射科，河南 鄭州 450052)

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是乳腺癌最主要的轉(zhuǎn)移途徑。內(nèi)乳淋巴結(jié)接受乳腺25%的淋巴液回流，其有無受累影響乳腺癌治療方案的選擇、臨床準(zhǔn)確分期及預(yù)后評估[1-2]。隨著前哨淋巴結(jié)(sentinel lymph node, SLN)活檢技術(shù)在臨床上的推廣應(yīng)用，內(nèi)乳區(qū)SLN活檢已成為臨床外科研究的熱點(diǎn)[3]，但常規(guī)影像學(xué)方法往往無法顯示內(nèi)乳SLN。MR淋巴造影(MR lymphography, MR-LG)已用于腋窩SLN顯像[4]。本研究探討MR-LG顯示兔VX2乳腺癌內(nèi)乳SLN的可行性，旨在為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取雌性健康新西蘭大白兔75只(由河南省實驗動物中心提供)，月齡5～8個月，體質(zhì)量1.5～1.8 kg，分為腫瘤組(n=55)或炎癥組(n=20)。

1.2 建立動物模型 腫瘤組：將VX2腫瘤(由Shope病毒致乳頭瘤惡變形成上皮細(xì)胞惡性腫瘤，經(jīng)過72次傳代后建株)軟組織塊剪成約1 mm3碎塊，以18G穿刺活檢針將其種植于實驗兔右側(cè)胸壁第2對乳頭的乳墊下，2周左右形成約“黃豆”大的實質(zhì)性腫塊，2～4周后以觸及實驗兔腋下腫大淋巴結(jié)為建立兔VX2乳腺癌模型成功。炎癥組：以5 ml注射器分別于實驗兔單側(cè)胸壁第2對乳墊下及上肢腋側(cè)皮下注射1 ml蛋黃乳膠(新鮮雞蛋黃與生理鹽水按10∶1配制，置勻漿器內(nèi)充分乳化)，5天后重復(fù)上述操作。實驗兔均按普通級動物給予分籠飼養(yǎng)，觀察腫瘤生長情況及腋窩淋巴結(jié)是否腫大，以觸及腋窩淋巴結(jié)腫大或移植腫瘤最大徑≥3 cm為MR-LG檢查的最佳時機(jī)。

1.3 儀器與方法 采用Philips Achieva 3.0T MR儀，SENSE XL TORSO TWO線圈。麻醉后將動物仰臥位、四肢伸展保定于約35 cm×35 cm自制檢查板上。先行常規(guī)平掃檢查，掃描范圍自鎖骨上窩至瘤體下緣，掃描序列及參數(shù)：軸位自旋回波T1W序列，TE 2 ms，TR 3 ms，F(xiàn)OV 180 mm×180 mm，層厚2 mm；軸位或冠狀位反轉(zhuǎn)恢復(fù)快速自旋回波T2W序列，TE 70 ms，TR 785 ms，F(xiàn)OV 210 mm×210 mm，層厚3 mm。之后腫瘤組于VX2腫瘤深部及內(nèi)側(cè)緣皮下分別注射釓噴酸葡胺注射液0.5 ml，炎癥組注射于乳暈區(qū)皮下，按摩3 min后再次行MR掃描，掃描序列為軸位及冠狀位T1W，掃描參數(shù)同平掃，并于5 min后再重復(fù)掃描1次。

采用ISP工作站進(jìn)行圖像后處理，將自注射部位至內(nèi)乳或腋窩方向的引流淋巴通路上最先顯像的1個或數(shù)個淋巴結(jié)定義為SLN，觀察并記錄SLN及其引流淋巴管顯像情況，并測量淋巴結(jié)大小。

1.4 SLN清掃術(shù)和術(shù)后病理學(xué)評價 于MR檢查后2天內(nèi)行淋巴結(jié)清掃術(shù)。術(shù)前24 h內(nèi)注射99mTc-硫膠體(核素強(qiáng)度0.7 mCi，直徑約10～20 nm，每個注射點(diǎn)注射0.5 ml)，注射方法同MR-LG，并于注射45～60 min后行核素淋巴顯像，以尋找腋窩和/或內(nèi)乳淋巴結(jié)的放射性熱點(diǎn)，并進(jìn)行體表標(biāo)記。麻醉、保定動物同MR-LG檢查，以相同方法注射亞甲藍(lán)(每個注射點(diǎn)1 ml)并按摩3 min后，經(jīng)耳緣靜脈空氣栓塞處死實驗兔。沿體表標(biāo)記在患側(cè)腋窩作約4 cm手術(shù)切口，切開皮下組織，尋找藍(lán)染淋巴管，并循淋巴管尋找藍(lán)染淋巴結(jié)；然后以γ探測儀檢出有放射性熱點(diǎn)的淋巴結(jié)。打開胸廓，在胸骨兩側(cè)尋找藍(lán)染及放射性計數(shù)增高的內(nèi)乳淋巴結(jié)。以藍(lán)染淋巴結(jié)、藍(lán)染淋巴管直接指向的淋巴結(jié)或放射性計數(shù)達(dá)到所檢出淋巴結(jié)最高放射性計數(shù)值10%的淋巴結(jié)均視為SLN，并手術(shù)摘除。記錄內(nèi)乳及腋窩SLN個數(shù)、大小，對手術(shù)摘除的淋巴結(jié)行常規(guī)HE染色后行病理學(xué)評價。將有癌細(xì)胞浸潤的SLN稱為陽性SLN，反之則為陰性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計分析軟件。對計量資料行正態(tài)性檢驗，服從正態(tài)分布的計量資料以±s表示，并行方差齊性檢驗，如方差齊，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗；不服從正態(tài)分布資料用中位數(shù)(上，下四分位數(shù))表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。分類資料用頻數(shù)及百分比表示，以χ2檢驗或Fisher精確檢驗比較組間差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

75只實驗兔中，73只建模成功，成功率97.33%(73/75)；2只失敗，其中腫瘤組1只腫瘤未生長，炎癥組1只因上肢、胸壁嚴(yán)重感染而死亡。73只實驗兔中，4只因麻醉過度或檢查后不明原因死亡，最終納入69只實驗兔，其中腫瘤組51只(圖1A、1B)，炎癥組18只。

2.1 內(nèi)乳SLN及淋巴管顯影情況 MR-LG對實驗兔內(nèi)乳SLN及內(nèi)乳淋巴管的顯示率分別為15.94%(11/69)和75.36%(52/69)，其中顯示淋巴結(jié)16枚、內(nèi)乳淋巴管79條。腫瘤組與炎癥組間內(nèi)乳SLN及內(nèi)乳淋巴管顯示情況差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05，表1、圖1C、1D)。

表1 腫瘤組及炎癥組實驗兔MR-LG顯示內(nèi)乳SLN及淋巴管情況

2.2 腫瘤組MR-LG顯示內(nèi)乳SLN的影響因素 腫瘤組MR-LG內(nèi)乳SLN顯示與未顯示實驗兔間體質(zhì)量、腫瘤生長時間，腫瘤長徑，腋窩SLN數(shù)目、長徑、陽性數(shù)目，內(nèi)乳淋巴管顯影情況差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05，表2)；腫瘤組內(nèi)乳淋巴管顯示與未顯示實驗兔間原發(fā)灶腫瘤大小及腋窩SLN數(shù)目差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05，表3)。

表2 腫瘤組實驗兔MR-LG顯示內(nèi)乳SLN的影響因素分析

表3 腫瘤組實驗兔MR-LG顯示內(nèi)乳淋巴管的影響因素分析

圖1 腫瘤組實驗兔 A.軸位T2WI示右側(cè)腹壁皮下腫塊(箭)，信號不均； B.病理圖示惡性腫瘤細(xì)胞(HE，×400)； C、D.MR-LG軸位T1WI示右側(cè)胸骨旁第2～3肋間內(nèi)乳SLN(C，黑箭)及內(nèi)乳淋巴管(D，白箭)，同時可見右側(cè)腋窩SLN(箭頭)顯影； E.術(shù)中見右側(cè)第2～3肋間藍(lán)染淋巴結(jié)； F.鏡下見淋巴結(jié)內(nèi)、尤其包膜下大量炎細(xì)胞浸潤，以粒細(xì)胞為主，未見腫瘤細(xì)胞(HE，×100)

2.3 MR-LG與SLN清掃術(shù)結(jié)果對比 SLN清掃術(shù)共檢出23只實驗兔31枚內(nèi)乳SLN，均為炎性改變(陰性SLN，圖1E、1F)。以手術(shù)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，MR-LG檢出內(nèi)乳SLN的準(zhǔn)確率、敏感度、特異度、假陰性率及假陽性率分別為76.81%(53/69)、39.13%(9/23)、95.65%(44/46)、60.86%(14/23)及4.35%(2/46)。MR-LG與SLN清掃術(shù)檢出的內(nèi)乳SLN的特征比較見表4，手術(shù)標(biāo)本測量內(nèi)乳SLN長徑、短徑均大于MR-LG測量值(P均<0.05)，而兩者長短徑比值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.195)。

表4 MR-LG與SLN清掃術(shù)檢出兔內(nèi)乳SLN特征比較(±s)

表4 MR-LG與SLN清掃術(shù)檢出兔內(nèi)乳SLN特征比較(±s)

檢出方式長徑(mm)短徑(mm)長徑/短徑MR?LG2．64±0．592．24±0．541．20±0．21SLN清掃術(shù)3．48±0．522．76±0．491．27±0．16t值-5．721-0．524-1．317P值<0．0010．0010．195

3 討論

既往研究[5-7]表明，采用VX2腫瘤組織塊原位種植建立乳腺癌動物模型及乳暈皮下注射新鮮雞蛋黃乳膠體建立兔炎性淋巴結(jié)動物模型簡單有效。本組建模成功率為97.33%(73/75)。腫瘤組1只未見明確腫瘤組織生長，可能與移植腫瘤組織塊活性、實驗動物個體免疫狀況及生長環(huán)境差異等有關(guān)；1只炎癥組兔因上肢、胸壁形成大片膿腫、嚴(yán)重感染死亡，可能與注射蛋黃乳膠量較多、進(jìn)針過深、穿破筋膜及實驗兔不耐受等因素有關(guān)。

乳腺SLN顯像檢查時，對比劑注射部位(乳暈區(qū)或腫瘤周圍皮下)鄰近腫瘤，對比劑流動方向與腫瘤淋巴引流方向一致，可較好地反映腫瘤病變的局部淋巴引流情況[8-9]。MR-LG檢查已用于顯像并初步評價乳腺癌腋窩淋巴結(jié)狀態(tài)[4，10-11]。

內(nèi)乳淋巴結(jié)位置較深，主要引流乳腺內(nèi)側(cè)及深部淋巴液，臨床主要通過術(shù)前淋巴閃爍顯像及術(shù)中γ探測儀對其進(jìn)行定位[2，12]。目前多將同位素示蹤劑注射于乳腺實質(zhì)或腫瘤深部，并采用雙象限兩點(diǎn)注射法[13]等改良核素示蹤劑注射技術(shù)[14]。本研究采用兩點(diǎn)注射法，將對比劑/示蹤劑注入乳腺實質(zhì)及腫瘤深部，以提高SLN顯像率。本組結(jié)果顯示，MR-LG對內(nèi)乳SLN及淋巴管的顯示率分別為15.94%(11/69)和75.36%(52/69)，提示MR-LG顯示兔VX2乳腺癌模型的內(nèi)乳SLN及其引流淋巴管具有可行性。以SLN清掃術(shù)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，本組MR-LG檢出內(nèi)乳SLN的準(zhǔn)確率較高，為76.81%(53/69)，且假陰性率及假陽性率均較低，表明MR-LG顯示實驗兔內(nèi)乳SLN及淋巴管具有較高價值。

原發(fā)灶腫瘤大小及腋窩淋巴結(jié)有無受累與內(nèi)乳淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[15-16]。本研究將觸及腋窩淋巴結(jié)腫大或移植腫瘤最大徑>3 cm作為影像學(xué)檢查的最佳時機(jī)，理論上可提高內(nèi)乳淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移率及顯像率。但本組MR-LG檢查中SLN總體顯示率僅為15.94%(11/69)，且均為炎性，與預(yù)期存在差異，可能與本組動物模型腫瘤侵襲性較弱、實驗動物個體免疫力較強(qiáng)或內(nèi)乳區(qū)淋巴結(jié)未見增大或轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示宜采用侵襲性較強(qiáng)的瘤株建立動物模型。本研究中內(nèi)乳SLN顯像與否與原發(fā)灶腫瘤大小及腋淋巴結(jié)狀態(tài)等均無明顯關(guān)系，可能與顯影內(nèi)乳SLN數(shù)目較少有關(guān)；而原發(fā)灶大小及腋淋巴結(jié)數(shù)目影響內(nèi)乳淋巴管的顯示，提示可進(jìn)一步調(diào)整檢查時機(jī)，以提高內(nèi)乳淋巴管顯示率。內(nèi)乳淋巴結(jié)處于乳腺淋巴引流通路，理論上提高內(nèi)乳淋巴管顯示率可相應(yīng)提高內(nèi)乳SLN顯示率，有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步觀察。

本研究中手術(shù)標(biāo)本測量的內(nèi)乳SLN長、短徑均大于MR-LG測量值，分析原因，手術(shù)標(biāo)本測量長徑為其三維最大徑，而MR-LG均在軸位圖像測量淋巴結(jié)長、短徑，受掃描層厚及測量誤差影響，所選測量層面可能非最大截面。另外，淋巴結(jié)長短徑比值主要反映淋巴結(jié)形態(tài)，MR-LG與手術(shù)檢出內(nèi)乳SLN比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明MR-LG圖像可基本反映淋巴結(jié)形態(tài)。

總之，以MR-LG顯示兔VX2乳腺癌模型內(nèi)乳SLN及其引流淋巴管具有可行性，尚需深入研究、改良方法，以提高其顯示率。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Cong BB, Qiu PF, Wang YS. Internal mammary sentinel lymph node biopsy: Minimally invasive staging and tailored internal mammary radiotherapy. Ann SurgOncol, 2014,21(7):2119-2121.

[2] Gnerlich JL, Barreto-Andrade JC, Czechura T, et al. Accurate staging with internal mammary chain sentinel node biopsy for breast cancer. Ann Surg Oncol, 2014,21(2):368-374.

[3] 邱鵬飛,趙榮榮,叢斌斌,等.乳腺癌內(nèi)乳區(qū)前哨淋巴結(jié)活檢術(shù)對淋巴分期和個體化治療的影響.中華腫瘤雜志,2016,38(1):42-47.

[4] Lu Q, Hua J, Kassir MM, et al. Imaging lymphatic system in breast cancer patients with magnetic resonance lymphangiography. PLoS One, 2013,8(7):e69701.

[5] 劉玉璽,孫業(yè)全,王苗苗,等.改良型乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型的制備及超聲表現(xiàn).中國醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志,2016,24(6):410-413.

[6] 孟珊,李傳明,楊新華,等.磁共振間質(zhì)淋巴造影診斷乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移.中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù),2013,29(12):1977-1980.

[7] 王志銘,劉欣,錢穎,等.兔乳腺腫瘤及炎性病變前哨淋巴結(jié)間接CT淋巴造影實驗研究.遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2010,31(4):289-292,381.

[8] Suga K, Ogasawara N, Okada M, et al. Interstitial CT lymphography-guided localization of breast sentinel lymph node: Preliminary results. Surgery, 2003,133(2):170-179.

[9] Suga K, Ogasawara N, Yuan Y, et al. Visualization of breast lymphatic pathways with an indirect computed tomography lymphography using a nonionic monometric contrast medium iopamidol:Preliminary results. Invest Radiol, 2003,38(2):73-84.

[10] Li C, Meng S, Yang X, et al. Sentinel lymph node detection using magnetic resonance lymphography with conventional gadolinium contrast agent in breast cancer: A preliminary clinical study. BMC Cancer, 2015,15:213.

[11] Shiozawa M, Kobayashi S, Sato Y, et al. Magnetic resonance lymphography of sentinel lymph nodes in patients with breast cancer using superparamagnetic iron oxide: A feasibility study. Breast Cancer, 2014,21(4):394-401.

[12] 叢斌斌,邱鵬飛,王永勝.乳腺癌內(nèi)乳區(qū)前哨淋巴結(jié)活檢術(shù)研究進(jìn)展.中華普通外科學(xué)文獻(xiàn)(電子版),2013,7(4):311-314.

[13] 邱鵬飛,劉雁冰,趙榮榮,等.乳腺癌內(nèi)乳區(qū)前哨淋巴結(jié)顯像新技術(shù).中華腫瘤雜志,2013,35(11):858-862.

[14] Qiu PF, Cong BB, Zhao RR, et al. Internal mammary sentinel lymph node biopsy with modified injection technique:High visualization rate and accurate staging. Medicine (Baltimore), 2015,94(41):e1790.

[15] Huang O, Wang L, Shen K, et al. Breast cancer subpopulation with high risk of internal mammary lymph nodes metastasis: Analysis of 2,269 Chinese breast cancer patients treated with extended radical mastectomy. Breast Cancer Res Treat, 2008,107(3):379-387.

[16] Lee HW, Kim SH. Breast magnetic resonance imaging for assessment of internal mammary lymph node status in breast cancer. J Breast Cancer, 2016,19(2):191-198.