SAT技術檢測結核桿菌rRNA對肺結核的快速診斷價值

許蘊怡 蔡杏珊 譚耀駒 劉燕文 曾少芳 馬品云 周輝林

廣州市胸科醫院檢驗科（廣州 510095）

中國的結核病流行趨勢令人關注。目前能否提供敏感、快速的抗結核療效指標指導臨床應用，至關重要。目前，結核病的實驗室檢查中的涂片熒光染色鏡檢法及快速培養法（Bactec MGIT960）仍然是確診肺結核的傳統方法，臨床監測療效可通過以下指標來考察：（1）2個月直接涂片陰轉率：現常用于結核病的控制指標，但耗時長，其在國內陽性率總體不高，僅為10%～30%［1］，敏感度低；（2）快速培養法（Bactec MGIT960）比前者優越，但檢測周期長，時間滯后于用藥，而限制其臨床應用；而兩者陽性者均難以鑒別結核及非結核桿菌，前者不能區分死活菌。

近年來，分子技術在國內外發展以及臨床廣泛應用，以RNA為靶標的診斷技術可以反映病原體的存活狀態，用于療效監測。SAT?TB技術是以MTB特異的16srRNA為靶標實時檢測，從而快速測出樣本中是否有活MTB存在。本研究通過SAT?TB技術對結核病患者的痰、支沖液標本進行檢測來判斷MTB的活菌是否存在，評價其對肺結核病的快速診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選則廣州市胸科醫院收集2015年9月22日至11月22日廣州市胸科醫院疑似肺結核患者痰液169份、支沖液151份，共計320份標本；同時進行SAT法、快速培養法（Bactec MGIT960）檢測。

1.2 主要試劑與儀器 試劑：結核分枝桿菌（TB）核酸檢測試劑盒（上海仁度生物科技公司，批號20150925）；熒光涂片法染色液及快速液體法培養液均由我院檢驗科自配；儀器：美國應用公司ABI7300熒光定量擴增儀；BACTEC MGIT960儀器。

1.3 方法

1.3.1 標本預處理 提取約2 mL左右的標本至50 mL離心管中，加1～2倍的2%N?乙酰半胱氨酸-氫氧化鈉前處理液（去污染），漩渦震蕩20 s，靜置15 min后，以3 200 r/min離心15 min，棄去上清，加入1 mL/管PBS緩沖液（pH=6.8）以中和PH至6.8，混勻備用。

1.3.2 SAT?TB檢測 取液化好的痰標本1 mL于EP管中，以13 000 r/min離心5 min，后棄上清，再加入1 mL PBS緩沖液重懸離心，棄上清。將痰液標本加入50 μL裂解液重懸，該樣品即為待測樣本，用超聲破碎儀破碎15 min，功率300 W。后將2 μL處理物加入含30 μL擴增檢測液的潔凈微量反應管或者反應板中。置恒溫熒光檢測儀上進行檢測。

1.3.3 快速液體培養法（Bactec MGIT960） 提取約2 mL左右的標本至50 mL離心管中，加1～2倍的2%N?乙酰半胱氨酸-氫氧化鈉前處理液（去污染），漩渦震蕩20 s，靜置15 min后，以3 200 r/min離心15 min，棄去上清，加入1 mL/管PBS緩沖液（pH=6.8）以中和PH至6.8，取液化后的痰標本放入BACTEC MGIT960儀器檢測。

1.4 統計學方法 采用SPSS 16.0統計軟件進行統計學分析。分別以快速液體培養法和臨床診斷為“金標準”，計算SAT檢測的靈敏度、特異性、陽性預測值、陰性預測值，突出比較BD960快速液體培養法和SAT法在痰液、支沖液的陽性檢出率，“率”用卡方檢驗比較，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 廣州市胸科醫院疑似肺結核患者的痰液169份、支沖液151份，共計320份標本進入最后研究。169例痰液標本患者中，男122例，女47例。痰液標本菌鑒結果為非結核分枝桿菌患者有8例，其中龜-膿腫分枝桿菌復合群3例，胞內分枝桿菌5例，3例非結核分枝桿菌感染患者的培養為陽性且SAT?TB為陰性。151例支沖液標本患者中，男97例，女54例。支沖標本菌鑒結果為非結核分枝桿菌患者有6例，其中龜-膿腫分支桿菌復合群3例，堪薩斯分枝桿菌2例，鳥-土分枝桿菌1例，2例非結核分枝桿菌感染患者的培養為陽性且SAT?TB為陰性。見表1、2。

表1 169例疑似肺結核患者痰液的BD960法與SAT法實驗結果Tab.1 The result of 169 sputum suspected MTB patients of BD960 and SAT?TB 例

表2 151例疑似肺結核患者支沖液的BD960法與SAT?TB法實驗結果Tab.2 The result of 151 BALF suspected MTB patients of BD960 and SAT?TB 例

2.2 以培養法為標準，SAT?TB檢測痰液、支沖液診斷肺結核的價值 BD960快培法在痰液、支沖液的陽性檢出率分別為：29.58%（50/169）和23.18%（35/151）；SAT?TB法在痰液、支沖液的陽性檢出率36.09%（61/169）和39.07%（59/151）。痰、支沖液兩者的陽性率比較：痰SAT法陽性檢出率較BD960快速培養法高6.51%，（χ2=59.34，P＜ 0.05）；支沖液SAT法陽性檢出率較BD960快速培養法高15.89%，（χ2=36.69，P＜0.05），差異均有統計學意義。SAT?TB檢測痰液、支沖液對肺結核患者的診斷價值見表3、4。

表3 SAT?TB檢測痰液對肺結核患者的診斷價值Tab.3 The diagnostic value of testing sputum MTB patients by SAT?TB

表4 SAT?TB檢測支沖液對肺結核患者的診斷價值Tab.4 The diagnostic value of testing BALF MTB patients by SAT?TB

2.3 以臨床診斷為標準，SAT?TB檢測痰液、支沖液診斷肺結核的價值 若以臨床診斷作為判斷肺結核為陽性標準，臨床診斷肺結核包括培陽及培陰肺結核，臨床診斷非肺結核或疑似肺結核為陰性標準，SAT法在痰液、支沖液標本對肺結核的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為：57.73%（56/97）、93.06%（67/72）、91.80%（56/61）、62.04%（67/108）；51.82%（57/110）、94.29%（39/41）、96.61%（57/59）、42.39%（39/92）；BD960法在痰液、支沖液標本的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為：51.55%（50/97）、95.83%（69/72）、94.34%（50/53）、59.48%（69/116）；33.64%（37/110）、90.24%（37/41）、90.24%（37/41）、33.64%（37/110）。

3 討論

多種結核桿菌的快速診斷方法均已建立，主要以DNA或者RNA作為檢測靶標的分子生物學技術，有噬菌體快速診斷法、基因芯片法［2-4］等。目前，一種以RNA為標本類型的檢測手段受到人們的關注，其原理是以MTB特異的16srRNA為檢測目標，通過實時熒光定量PCR技術，快速判斷MTB是否存在［5］，又可反映是否存在活菌，優于直接涂片熒光法和BD960法，與前者比較，操作時間從1 d縮短到1.5 ～ 2 h［6］；與后者比較，SAT?TB法檢測痰液/支沖液操作完成總共時間平均為1.5～2 h，BD960快培法平均報陽時間約為14～21 d，檢測時間上優于BD960法［6-10］。

現在常用熒光探針定量PCR技術與SAT?TB技術相比，均具有快速的優點。前者擴增產物為DNA無法做活菌診斷，更不能反映活菌的量，無法監測患者的用藥療效，不利于臨床調整用藥方案。并且DNA也較易在實驗室中產生污染；后者則可彌補其不足。

本研究結果顯示：BD960快培法和SAT法在痰液、支沖液的陽性檢出率分別為：29.58%（50/169）和 23.18%（35/151）、36.09%（61/169）和37.75%（57/151）。痰標本兩者的陽性率比較，SAT?TB法陽性檢出率較BD960快速培養法高6.51%，差異有統計學意義（χ2=59.34，P＜ 0.05）；支沖液兩者的陽性率比較，SAT陽性檢出率較BD960快速培養法高15.89%，“率”之間的比較，差異存在統計學意義（χ2=36.69，P＜0.05）。SAT法在痰液、支沖液標本的敏感度分別為：84%（42/50）；89%（33/37）。用 LE PALUD 等［11］用 Xpert Mtb/RIF檢測BALF對培陽標本的敏感度為80%，特異度為98.6%；其他方法如KIM等［12］研究巢式PCR法診斷結核病的敏感度僅為69.4%。以IS6110為基礎的環介導恒溫擴增法（LAMP）［13］檢測呼吸道標本診斷肺結核的敏感度可達89.6%。因此，與其他最新使用的分子生物學診斷技術比較，SAT?TB法檢測BALF診斷結核病的敏感度與最新使用的其他分子生物學技術Xpert Mtb/RIF相似，比經典PCR法敏感度高。所以，SAT?TB法檢測支沖液能提供較高的敏感度和特異度。

此外，在痰、支沖液中SAT?TB法檢測結果與BD960法的一致率達81.66%、76.16%，也就是說SAT?TB法能夠在最短的時間內提供準確率為81.66%或76.16%的診斷結果；SAT法在痰液、支沖液的陽性檢出率36.09%、39.07%略高于BD960快培法29.58%、23.18%。

從數據中卻不難發現，50例痰培陽標本中有8例SAT?TB法陰性，37例痰培陽標本中有4例SAT?TB陰性，說明產生假陰性結果，與BD960快速培養法比較痰、支沖液的SAT?TB法的檢出率分別為84%、89%，而非100%，而痰中14例、支沖液中24例卻被SAT?TB法檢出陽性。因此，若以臨床診斷肺結核為計算肺結核陽性標準，臨床上仍有約10%～20%的培陽患者無法通過SAT?TB法檢出，但結果證明SAT?TB法對肺結核的檢出率略高于BD960快速培養法。兩者存在各自的優點，究其原因可能有：（1）SAT?TB法的靶標為RNA，它降解的速度快，對于菌量未足的標本會因處理時間過長，RNA降解后而不被檢出，這與操作者控制試驗的時間至關重要。而BD960快速培養法中不存在RNA降解的問題，只是在固定時間范圍內達到一定的菌量即可在液體培養基生長。因此，因不同操作者而得出的不同的陽性檢出率。（2）當患者可能是結核桿菌與非結核桿菌感染混合感染時，會干擾SAT?TB法對結核桿菌的檢出，而培養法可以為陽性。因此，BD960快速培養法與SAT?TB法可以同時用于臨床輔助診斷，但本研究證明：SAT?TB法檢測痰液和支沖液標本中的結核分枝桿菌，具有快速、敏感度高、特異度和陽性率較好的優點，可區分結核和非結核桿菌。因此，SAT?TB法為一項有價值的輔助臨床診斷的工具之一。

綜上所述，該技術的今后臨床使用中，若能增加患者的標本量或在用藥的不同時段增加該項目的檢測，對藥物治療的跟蹤監測具有非常重要的意義，這是單純依靠BD960快速培養法在此方面是無法比擬的；若能把SAT?TB法聯合BD960法一起使用，可能會進一步提高檢測的敏感度。因此，SAT?TB法技術在臨床上是值得廣泛推廣應用的。

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