冠狀動脈嚴重狹窄患者血漿miRNA?195表達及其與側支循環形成的關系

鄭穎 李強 陽慧 林德洪 邢波

中南大學湘雅醫學院附屬?？谑腥嗣襻t院心內科（?？?570208）

冠狀動脈側支循環（coronary collateral circula?tion，CCC）形成是心肌缺血缺氧后建立起來的代償機制，有助于緩解臨床癥狀，提高生存質量［1］。目前認為，側支循環的形成受冠狀動脈狹窄程度的影響［2］，但是其中的分子機制尚不明確。miR?NAs作為高度保守的非編碼小RNA，參與了眾多生物過程的調控［3］。miRNA?195是 microRNA?15/16/195/424/497 家族中的一員［4］，有研究［5］表明，miRNA?195參與了多種心血管疾病的進展過程。為此，本研究試圖探討冠狀動脈嚴重狹窄患者血漿miRNA?195的表達及其與側支循環形成的關系，目的在于發現對于冠狀動脈側支循環形成有價值的生物標記物?，F報道如下。

1 對象與方法

1.1 病案選取 入選病例為2016年3月-2017年5月期間我院血管內科住院并接受選擇性冠狀動脈造影（Coronary angiography，CAG）檢查的患者，共190例。納入標準：（1）符合2014年美國心臟病學院（American College of Cardiology，ACC）和美國心臟協會（American Heart Association，AHA）修訂版診療指南中的診斷標準［6］；（2）CAG提示左前降支、左回旋支和右冠狀動脈3支中至少1支狹窄程度≥90%。排除標準：（1）既往有冠狀動脈旁路移植（Coronary artery bypass grafting，CABG）手術史；（2）既往有經皮冠狀動脈介入（Percutaneous coro?nary intervention，PCI）治療史；（3）冠狀動脈畸形；（4）伴有冠狀動脈心肌橋；（5）伴有瓣膜性心臟?。唬?）急性心肌梗死；（7）急診CAG 或PCI；（8）伴有嚴重感染、腫瘤、肝腎功能不全等。本研究經所有入選者及家屬知情簽字，醫院倫理委員會通過。

1.2 方法

1.2.1 冠狀動脈造影以及冠狀動脈病變程度的評估 選擇橈動脈或股動脈穿刺行CAG檢查。儀器為Philips HC500型心血管專用X線機，視野為7英寸，12.5f/s采集。圖像以512×512矩陣、DICOM格式儲存、刻盤。

冠狀動脈病變程度的評估采用Gensini積分法［7］。按照AHA制定的冠狀動脈血管圖像記錄分段評估標準評定所有分支血管的病變程度，狹窄程度≤25%為1分，25%～49%之間為2分，50%～74%之間為4分，75%～89%之間為8分，90%～99%之間為16分，100%為32分。不同節段冠狀動脈病變程度分別為各自評分乘以相應系數，具體為：左冠狀動脈主干病變程度＝得分X5，左前降支近段病變程度＝得分X 2.5，左前降支中段病變程度＝得分X 1.5，左前降支遠段病變程度＝得分X1，對角支（D1）病變程度＝得分X1，對角支（D1）病變程度＝得分X0.5，左回旋支近段病變程度＝得分X 2.5，左回旋支遠端病變程度＝得分X1，后降支病變程度＝得分X1，后側支病變程度＝得分X 0.5，右冠病狀動脈近段、中段、遠段和后降支病變程度（均）＝得分X1。最終積分為所有病變分支積分之和。

1.2.2 冠狀動脈側支循環的分級 采用Rentrop法［8］對冠狀動脈側支循環進行分級，具體為：（1）0級：無任何側支循環被造影劑充盈；（2）1級：造影劑充盈側支循環病變血管的分支，但沒有到達心外膜下血管段；（3）2級：造影劑充盈部分心外膜下血管段；（4）3級：造影劑充盈整個心外膜下血管段。其中，0、1級視為側支循環不良，2、3級視為側支循環良好。

1.2.3 血漿miRNA?195的檢測 所有入選患者者在入院后第2天清晨于空腹狀態下采肘靜脈血5 mL，對照組在體檢當天上午空腹狀態下采肘靜脈血5 mL，置于EDTA抗凝試管中，室溫下靜置20 min，3 000 r/min離心15 min，分離血漿置于1.5 mL EP管中，-20℃保存。

采用Trizol溶液（美國Invitrogen生產）提取總RNA。步驟如下：（1）冰上融化冷凍血漿；（2）取250 μL血漿和1 mL Trizol置入無Rnase的EP管中，渦旋混勻，室溫下靜置5 min；（3）加入0.2 mL氯仿，振蕩15 s后，室溫下靜置5 min；（4）4 ℃，12 000 r/m離心10 min，取0.5 mL上層水相，置入另外的無Rnase的 EP管中；（5）加入0.5 mL異丙醇，渦旋混勻，室溫下靜置5 min；（6）4℃，12 000 r/min離心10 min，去上清，RNA沉淀于離心管管底；（7）加入75%乙醇1 mL，洗滌RNA沉淀，4℃，12 000 r/min離心2 min，去上清；（8）4℃，12 000 r/min離心1 min，去上清；（9）晾干，置于空氣中 5～10 min，干燥RNA 沉淀；（10）加入 10～20 μL DEPC H2O 溶解RNA沉淀。

PCR擴增。引物由生工生物工程有限公司生產，miRNA?195 的上游引物5′?UAGCAGCACAGA?AAUAUUGGC?3′，下游引物 5′?CAAUAUUUCU?GUGCUGCUAUU?3′；引物序列正義鏈5′?ACCATG?GATGATGATATCGCC?3′，反義鏈 5′?GCCTTGCA?CATGCCGG?3′；反應條件：95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、60℃ 1 min，50個循環。

測序與分析。將miRNA逆轉錄為cDNA，采用熒光定量的方法檢測（熒光定量檢測試劑盒由北京全式金生物技術有限公司生產），miRNA?195的表達量 =2-ΔCT，ΔCT=CT（miRNA?195）－CT（內參引物）（內參引物為18sRNA引物，由生工生物工程有限公司生產）。

1.2.4 血漿血管內皮生長因子（vascular endothe?lial growth factor，VEGF）的檢測 所有入選患者者在入院后第2天清晨于空腹狀態下采肘靜脈血5 mL，對照組在體檢當天上午空腹狀態下采肘靜脈血5 mL，EDTA抗凝，室溫下靜置20 min，2 000 r/min離心10 min，分離血漿轉入EP管中，-20℃保存。采用ELISA法檢測血漿VEGF水平（試劑盒由美國R&D公司生產并提供）。

1.3 統計學方法 采用SPSS 19.0進行分析處理。計量資料的正態檢驗采用One?Sample Kolmogorov?Smirnov Test法，正態分布的計量數據用±s表示，兩組間數據比較采用t檢驗；計數資料采用率或百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性檢驗采用Persona分析；取P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 比較側支循環不良組與側支循環良好組的基線指標 Rentrop法分級顯示，入選患者中側支循環不良者90例，側支循環良好者100例。經過比較發現，除了側支循環良好組的Gensini積分明顯高于側支循環不良組，差異具有統計學意義（P＜0.05），其他所有基線指標差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性，見表1。

表1 側支循環不良組與側支循環良好組基線指標的比較Tab.1 Comparison of baseline indicators between poor collateral circulation group and good collateral circulation group ±s

表1 側支循環不良組與側支循環良好組基線指標的比較Tab.1 Comparison of baseline indicators between poor collateral circulation group and good collateral circulation group ±s

注：性別★、糖尿病★、高血壓★、吸煙史★、服用ACEI/ARB類藥物★、服藥β-受體阻滯劑★、服用他汀類藥物★采用χ2檢驗，其余基線指標采用t檢驗

基線指標性別★男［例（%）］女［例（%）］年齡（歲）病程（年）糖尿病［例（%）］★高血壓［例（%）］★吸煙史［例（%）］★服用ACEI/ARB類藥物［例（%）］★服藥β-受體阻滯劑［例（%）］★服用他汀類藥物［例（%）］★TG（mmol/L）TC（mmol/L）HDL?C（mmol/L）LDL?C（mmol/L）Gensini積分側支循環不良組（n=90） 側支循環良好組（n=100）t（χ 2）值0.217 P值0.642 51（56.67）39（43.33）61.45±7.33 5.13±0.62 26（28.89）39（43.33）18（20.00）51（56.67）59（65.56）80（88.89）1.75±0.22 5.19±0.67 0.95±0.05 3.70±0.45 67.51±8.55 60（60.00）40（40.00）61.89±8.13 5.30±0.71 42（42.00）51（51.00）25（25.00）63（63.00）73（73.00）95（95.00）1.79±0.25 5.25±0.72 0.96±0.06 3.75±0.51 118.35±14.56 0.390 1.749 2.580 1.117 0.676 0.792 1.238 2.433 1.165 0.593 1.240 0.713 29.690 0.697 0.082 0.108 0.291 0.411 0.374 0.266 0.119 0.245 0.554 0.216 0.477 0.000

2.2 比較側支循環不良組與側支循環良好組的血漿miRNA?195和VEGF水平 結果顯示，側支循環良好組的血漿miRNA?195和VEGF水平均明顯高于側支循環不良組，差異具有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 側支循環不良組與側支循環良好組血漿miRNA?195和VEGF水平的比較Tab.2 Comparison of plasma miRNA?195 and VEGF levels between poor collateral circulation group and good collateral circulation group ±s

表2 側支循環不良組與側支循環良好組血漿miRNA?195和VEGF水平的比較Tab.2 Comparison of plasma miRNA?195 and VEGF levels between poor collateral circulation group and good collateral circulation group ±s

組別側支循環不良組側支循環良好組t值P值例數90 100血漿miRNA?195（2－ΔCT）4.45±0.40 7.62±0.85 33.410 0.000血漿VEGF（ng/L）215.25±25.62 364.08±38.52 31.637 0.000

2.3 所有入選患者血漿miRNA?195與VEGF水平的相關性分析 Person相關分析顯示，冠心病患者血漿miRNA?195與VEGF水平呈正相關性（r=0.628，P=0.022）。

2.4 所有入選患者血漿miRNA?195與Gensini積分的相關性分析 Person相關分析顯示，冠心病患者血漿miRNA?195與Gensini積分呈正相關性（r=0.765，P=0.013）。

3 討論

側支循環能夠代償地供血的不足，保護左室功能、縮小梗死面積，減少各種心臟不良事件的發生率，是缺血性心臟病的重要保護機制［1］。目前，由于側支循環需要經過CAG這樣的有創檢查才能夠被證實，因此尋找一種可以預測側支循環形成的生物標記物具有一定的臨床意義。

研究顯示［9］，miRNAs在病理過程中的變化較其他生物標記物要早，并且血漿中的miRNAs大多與蛋白結合或被脂質包膜包裹，穩定性高，不容易被RNA酶降解，因此將血漿中的miRNA作為疾病檢測的生物學標記物具有可操作性。研究已證實［10］，miRNA?195在心血管疾病的進程中起著重要作用，在急慢性缺血性心臟病的心肌肥厚、心肌纖維化的過程中均發現有miRNA?195的參與，在主要的心血管細胞中（內皮細胞、平滑肌細胞）均發現miRNA?195的高表達，甚至是心血管疾病進程中的差異性表達。本研究就發現，在冠狀動脈嚴重狹窄的患者中，側支循環良好組的血漿miR?NA?195明顯高于側支循環不良組，與有關文獻的結果吻合。

VEGF在新生血管的生成過程中具有重要作用，側支循環的血管生成大約需要10 ～ 14 d［1］，動物實驗的結果顯示，大鼠急性心梗模型術后14 d VEGF動態水平達到峰值［11］，犬心肌缺血模型術后21 d的VEGF呈現持續上升趨勢［12］。有學者指出［13］，可能是miRNA以調控VEGF的方式誘發了側支循環的形成，但并未肯定是miRNA?195。有文獻表明［14］，血漿VEGF水平與側支循環的形成情況呈正相關性，即血漿VEGF水平越高則側支循環越良好。本研究顯示，側支循環良好組的血漿VEGF水平均高于側支循環不良組，與文獻結論一致。

本研究經過Person相關分析發現，冠心病患者血漿miRNA?195與VEGF水平呈正相關性。MA等［15］發現，miRNAs作為缺氧性誘導基因，在其表達上調后能夠引發白細胞的增加和NF?kB表達的上調，促使IL?6、IL?8等炎性因子的釋放，從而加強機體的炎性反應，在持續炎癥反應的作用下，VEGF釋放增加促發了新生血管的生成。雖然目前并未見文獻顯示miRNA?195直接參與了VEGF表達的上調，但是可以推測血漿miRNA?195與VEGF水平具有比較密切的關系。

本研究最后的數據分析顯示，冠心病患者血漿miRNA?195與Gensini積分呈正相關性。目前臨床上普遍認為［16］，冠狀動脈的狹窄程度是側支循環形成的主要影響因素，狹窄程度越嚴重則對側支循環形成的影響越大，當狹窄程度超過冠狀動脈的90%時候，其影響程度達到最大。因此可以認為，冠狀動脈嚴重狹窄后，在機體缺血缺氧等因素的作用下誘發了miRNA?195表達的上調。

綜上所述，冠狀動脈嚴重狹窄患者側支循環的形成過程中，miRNA?195可能是通過調控VEGF誘導著新生血管生成的相關通路發揮著重要作用，因此可以嘗試將其作為預測側支循環形成的生物標記物供臨床參考。

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