白細(xì)胞介素?18在膿毒癥血小板減少癥中的表達(dá)及臨床意義

李健 許華 王兵 王勇強(qiáng)

天津市第一中心醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科/天津市急救醫(yī)學(xué)研究所（天津 300192）

據(jù)統(tǒng)計(jì)，35%～59%的膿毒癥患者曾發(fā)生血小板減少，且其與生存率呈負(fù)相關(guān)，感染誘發(fā)的血小板減少癥（thrombocytopenia，TCP）是膿毒癥患者死亡的危險(xiǎn)標(biāo)志之一［1-3］。因此，及早發(fā)現(xiàn)并干預(yù)可能引起TCP的危險(xiǎn)因素，及時(shí)恢復(fù)患者血小板低計(jì)數(shù)狀態(tài)是降低膿毒癥TCP患者病死率的關(guān)鍵所在。然而，目前關(guān)于膿毒癥TCP的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，它與機(jī)體全身炎癥網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)、免疫功能障礙以及宿主對(duì)不同感染病原微生物及其毒素的異常反應(yīng)密切相關(guān)［4］。白細(xì)胞介素?18（IL?18）是一種在體內(nèi)分布較為廣泛的促炎細(xì)胞因子，研究顯示IL?18能夠準(zhǔn)確反映膿毒癥的嚴(yán)重程度并且與其預(yù)后密切相關(guān)［5-6］。而目前對(duì)IL?18在膿毒癥TCP患者中的表達(dá)情況以及其與血小板減少的相關(guān)性尚鮮見報(bào)道。本研究通過收集并檢測(cè)膿毒癥患者及膿毒癥TCP患者血清IL?18的表達(dá)水平及血小板計(jì)數(shù)和28 d生存率，初步探討IL?18與膿毒癥TCP的相關(guān)性及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012年6月至2014年5月入住天津市第一中心醫(yī)院ICU的患者60例，其中膿毒癥患者32例，膿毒癥TCP患者28例。入選病例符合2001年國(guó)際膿毒癥會(huì)議關(guān)于膿毒癥診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］，觀察期間兩次或以上住入ICU，只第一次列入觀察范圍。排除標(biāo)準(zhǔn)：惡性腫瘤；免疫系統(tǒng)疾病，造血系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p傷及惡性腫瘤；年齡＜14歲或＞75歲，心肺復(fù)蘇后，終末期肝或腎功能衰竭者，入院24 h內(nèi)死亡者。疾病的嚴(yán)重程度采用急性生理和慢性健康狀況評(píng)分Ⅱ（APACHEⅡ）進(jìn)行評(píng)價(jià)。以外周血小板計(jì)數(shù)＜100×109/L至少2次作為血小板減少的標(biāo)準(zhǔn)。全部患者的細(xì)菌培養(yǎng)（痰液、血液、尿液、引流液）均為陽性。

本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)天津市第一中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有治療方案均獲得患者家屬知情同意。

1.2 臨床指標(biāo)觀察與檢測(cè) 于入院24 h內(nèi)取外周靜脈血，檢測(cè)血小板計(jì)數(shù)（PC）、全血白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、C反應(yīng)蛋白（CRP）及纖維蛋白原的表達(dá)情況。記錄APACHEⅡ評(píng)分、ICU住院時(shí)間、出血事件、感染位點(diǎn)及28 d病死率。

1.3 外周血中IL?18表達(dá)檢測(cè) 采用RT?PCR方法檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中IL?18 mRNA水平的表達(dá)，采用密度梯度離心法分離外周血中單個(gè)核細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，并檢測(cè)RNA的純度和濃度，A260/A280值均在1.8～ 2.0之間。之后將1 μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT?PCR引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成（具體序列見表1）。選用SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa公司）試劑盒以及ABI PRISM?7500擴(kuò)增儀進(jìn)行RT?PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件設(shè)定參照試劑盒說明書。每樣本設(shè)平行反應(yīng)孔3個(gè)。以GAPDH為內(nèi)參，取平均Ct值計(jì)算2?△△Ct值，作為各樣本mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)外周血中的IL?18，按照IL?18酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒（NeoBioscience Tech?nology公司）說明書將血液樣本短暫離心并檢測(cè)。

表1 RT?PCR引物序列Tab.1 Sequences of primers for real time PCR

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。均數(shù)間差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的檢驗(yàn)采用t?test，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般資料比較 膿毒癥患者32例，膿毒癥TCP患者28例，兩組患者性別、年齡、APACHEⅡ評(píng)分、WBC、CRP及纖維蛋白原等比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2；初次感染位點(diǎn)、感染源、器官損傷種類及數(shù)量差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表2 兩組患者臨床特征比較Tab.2 Clinical characteristics of patients ±s

表2 兩組患者臨床特征比較Tab.2 Clinical characteristics of patients ±s

注：與膿毒癥組比較，**P＜0.001

臨床特征性別（男/女）年齡（歲）APACHEⅡ評(píng)分（分）PC（× 109/L）WBC（× 109/L）CRP（mg/dL）纖維蛋白原（g/L）膿毒癥組16/16 63（23 ～ 82）23.9±6.8 124.35±63.41 11.80±1.76 9.4（3.0 ～ 29.8）4.8±1.2膿毒癥TCP組13/15 60（19 ～ 74）21.2±8.3 20.93±4.71**10.12±2.56 10（2.3 ～ 34.6）5.1±2.2

表3 兩組患者感染位點(diǎn)、器官損傷等基線情況比較Tab.3 Baseline characteristics of sepsis patients and severe sepsis patients with thrombocytopenia 例（%）

2.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞中IL?18的表達(dá) 膿毒癥患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中IL?18 mRNA的表達(dá)量高于膿毒癥TCP患者（P=0.015，圖1）；通過對(duì)兩組患者血清中IL?18含量的檢測(cè)，結(jié)果顯示膿毒癥患者血清中IL?18的含量高于膿毒癥TCP患者（P=0.034，圖2）。

圖1 兩組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中IL?18 mRNA的表達(dá)情況Fig.1 Expression levels of IL?18 mRNA in PBMCs of sepsis patients and severe sepsis patients with thrombocytopenia

圖2 兩組患者血清中IL?18的表達(dá)情況Fig.2 Plasma concentrations of IL?18 in sepsis patients and severe sepsis patients with thrombocytopenia

3 討論

膿毒癥是嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、休克、感染、大手術(shù)等臨床急、危重患者的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，亦是誘發(fā)膿毒性休克、多器官功能障礙綜合征的重要因素，嚴(yán)重威脅人類健康［8］。膿毒癥患者的TCP發(fā)生率較高，其血小板減少程度和持續(xù)時(shí)間在預(yù)測(cè)膿毒癥患者死亡率方面具有重要作用［9-10］。因此，明確膿毒癥TCP發(fā)病機(jī)制，針對(duì)性地糾正膿毒癥患者血小板的減少狀態(tài)是解決膿毒癥高死亡率的難點(diǎn)之一。然而目前有關(guān)膿毒癥相關(guān)TCP的發(fā)病機(jī)制尚未明確。本研究檢測(cè)了IL?18在膿毒癥及其相關(guān)TCP患者中的表達(dá)情況，為探討膿毒癥相關(guān)TCP的發(fā)病機(jī)制提供臨床檢測(cè)數(shù)據(jù)。

IL?18是一種在體內(nèi)分布較為廣泛的促炎癥細(xì)胞因子，可促進(jìn)INF?γ的產(chǎn)生，在感染及炎癥的起始免疫反應(yīng)中具有重要調(diào)控作用［11］。研究顯示IL?18直接與膿毒癥患者的死亡率相關(guān)，血漿中IL?18的水平可作為膿毒癥患者不良預(yù)后的指標(biāo)，且獨(dú)立于其他免疫因子尤其是 IL?1β［5］；與此相符，ENDO等［12］檢測(cè)13例膿毒癥患者的血清IL?18水平，發(fā)現(xiàn)其與膿毒癥APACHEⅡ評(píng)分類似，能夠準(zhǔn)確反映疾病的嚴(yán)重程度；OBERHOLZER等［13］則進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)IL?18在膿毒癥患者中明顯升高，死亡的膿毒癥患者和膿毒癥休克患者的IL?18水平比存活者和無休克的膿毒癥患者的水平高；孫榮青等［14］檢測(cè)ICU膿毒癥患者的前3天IL?18水平結(jié)果同樣顯示：升高的IL?18水平與膿毒癥患者疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后密切相關(guān)。由此可見，IL?18與膿毒癥患者疾病嚴(yán)重程度及預(yù)后密切相關(guān)。然而關(guān)于IL?18與血小板減少的相關(guān)性鮮見報(bào)道，在本研究中，筆者收集并檢測(cè)了60例膿毒癥患者及膿毒癥TCP患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中IL?18 mRNA的表達(dá)以及血清中IL?18的表達(dá)情況，結(jié)果顯示IL?18在膿毒癥TCP患者中的表達(dá)水平高于膿毒癥患者（P=0.015，P=0.034）。結(jié)合兩組患者臨床特征及基線情況，可見IL?18與膿毒癥患者血小板減少程度呈負(fù)相關(guān)，與膿毒癥患者疾病程度呈正相關(guān)。該結(jié)果不僅驗(yàn)證了前人所報(bào)道的IL?18與膿毒癥患者的病情嚴(yán)重程度及預(yù)后密切相關(guān)，還證實(shí)了IL?18與膿毒癥患者中血小板減少程度相關(guān)，揭示了IL?18與膿毒癥TCP患者的病情嚴(yán)重程度的相關(guān)性，具有一定的臨床意義，然而本研究?jī)H處于初步探索階段，對(duì)于IL?18是否參與膿毒癥TCP的發(fā)病過程及其可能的機(jī)制仍需進(jìn)一步深入的研究。

IL?1β是IL?1家族的主要成員并且以往研究顯示，IL?1β 在膿毒癥中扮演著重要的角色：IL?1β在血小板內(nèi)存在自分泌環(huán)路，在LPS刺激下該分泌方式是血小板級(jí)聯(lián)活化的必須因素并被視為一種可促進(jìn)血栓形成的血小板興奮劑［15］；并且研究還指出IL?1α和IL?1β能夠作為TLR4的內(nèi)生性配體通過侵入并激活LPS結(jié)扎的TLR4信號(hào)通路而產(chǎn)生無菌炎癥［15］。最新研究報(bào)道顯示與IL?1β同屬于IL?1家族并且活化都依賴于Caspase?1炎性小體的IL?18在腎功能障礙患者中的產(chǎn)生與激活均依賴于TLR4信號(hào)通路，并且IL?18能夠促進(jìn)TLR4的表達(dá)及活性氧（ROS）的產(chǎn)生，而ROS能夠刺激NLRP3進(jìn)而促進(jìn)炎性小體的形成，由NLRP3、ASC和Caspase?1形成的炎性小體又可以激活I(lǐng)L?18前體［16-21］。此外研究還報(bào)道血小板也能夠獨(dú)自合成剪切和釋放IL?18，并且報(bào)道揭示在人體血液中的IL?18大都來源于血小板［22］。因此，筆者推測(cè)IL?18很有可能在血小板內(nèi)也存在自分泌環(huán)路，并且參與膿毒癥相關(guān)TCP的發(fā)病過程。然而其具體的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

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