條件性胰島β細胞DEPTOR 基因敲除小鼠構建及鑒定

賴舒暢 邱鴻 王肖 潘道延 王楨鈺 李凱 白曉春 沈潔

1南方醫科大學第三附屬醫院內分泌科（廣州 510515）；2南方醫科大學第三附屬醫院醫學實驗研究中心（廣州 510515）；3廣州中醫藥大學經濟與管理學院（廣州 510515）

糖尿病的病因十分復雜，遺傳、環境、行為等多種因素共同參與、相互作用而導致糖尿病的發生。全球的糖尿病患者超過4.15億，預計到2040年前，全球將有6.42億糖尿病患者，這將給個人及社會帶來嚴重的經濟負擔［1］。

哺乳類動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種高度保守的絲氨酸-蘇氨酸類激酶，通過在體內形成兩種不同的復合體對機體生長、代謝產生調控作用。mTOR與肥胖、糖尿病等代謝性疾病關系密切，在胰島素信號通路，胰島β細胞生長、發育、增殖以及調控代謝調節激素的合成分泌等多種途徑中發揮重要作用［2-3］。DEPTOR 是 2009 年，PETERSON 等［4］發現一類新的mTOR結合蛋白，能夠負性調節mTORC1和mTORC2的活性。盡管許多體外實驗已經證實DEPTOR負性調控mTOR的作用，DEPTOR在體內的作用仍然很少被了解。近年來研究發現，DEP?TOR對細胞代謝也有著重要的影響。然而，目前對DEPTOR在代謝中作用的研究多數集中在細胞和分子水平，為進一步了解DEPTOR的作用，本課題組根據國際上常用的Cre/loxp系統原理，利用DEPTORloxp/loxp小鼠和胰島β細胞特異性表達Cre重組酶小鼠Ins1?Cre/ERT小鼠，成功構建并鑒定了可誘導性胰島β細胞DEPTOR基因敲除小鼠模型，為在整體動物水平研究DEPTOR基因在胰島β細胞中的作用及糖尿病的發病機制提供了研究平臺。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 鼠尾基因組DNA裂解液（A/B液）南方醫科大學第三附屬醫院中心實驗室配制：A液（0.5%SDS、0.1M NaCl、0.05M EDTA、0.01M Tris.C1 pH8.0、100 μg/mL蛋白酶K），B液（NAOH 1 mmol/mL）；DNA Marker（Gen Star，Lot#6BB02）、瓊脂糖（BIOFROXX）購自廣州斯佳生物有限公司；EB替代物（GR501?01）、PCRmix（P212?02）南京諾唯贊生物科技有限公司；PCR、QPCR引物均為上海生物工程有限公司合成；DEPTOR一抗、熒光二抗（Abcam）購自廣州新晉生物有限公司；Insulin一抗（santa cruz），DAPI（invitrogen）購自廣州杰特偉生物科技有限公司；其他常用試劑：EDTA、Tris堿、鹽酸、氫氧化鈉、等均為國產分析純。

1.2 實驗動物

1.2.1 條件性胰島β細胞特異表達Cre重組酶小鼠 B6.Cg?Tg（Ins1?cre/ERT）1Lphi/J小鼠（JAX#024709，以下簡稱Cre小鼠）由上海茂生生物有限公司代理從美國JACKSON實驗室引進。

1.2.2 DEPTORloxp/loxp小鼠DEPTORtm1a（EUCOMM）

Wtsi克隆胚胎干細胞EPD0556_1_H09購自歐洲突變小鼠資源庫（EUCOMM ID：41725，德國），種系傳播嵌合小鼠由上海南方模式生物中心構建。野生型（C57BL/6）小鼠購自南方醫科大學實驗動物中心。

1.2.3 兩種基因小鼠的飼養和繁殖 將小鼠置于潔凈的層流動物房內，室內溫度控制在20～25℃，濕度控制在40%～70%，12 h光照，晝夜交替。DEPTORloxp/loxp采用雌雄均為DEPTORloxp/loxp的純合子進行交配繁殖，Cre小鼠采用Cre重組酶雜合子（Cre+/-）和野生型小鼠進行交配繁殖。動物實驗經過南方醫科大學倫理委員會審核。

1.2.4 條件性胰島β細胞DEPTOR基因敲除小鼠的構建流程 基于Cre/loxp系統原理，構建流程如下：DEPTORloxp/loxp小鼠與Cre+/-小鼠交配，得到F1代DEPTORloxp/-。Cre+/-小鼠。獲得的F1代DEPTORloxp/-。Cre+/-小鼠再與DEPTORloxp/loxp小鼠交配，得到DEP?TORloxp/lox.Cre+/-小鼠。DEPTORloxp/lox.Cre+/-基因型小鼠即為本實驗所要構建模型小鼠的基因型。在小鼠胰島β細胞中，胰島素與外源性他莫昔芬同時作用下可誘導Cre重組酶表達，Cre重組酶能有效切除兩個LoxP位點間的序列。因此通過控制外源性注射他莫昔芬時間可獲得不同周齡胰島β細胞DEPTOR基因敲除小鼠。

1.3 小鼠基因型鑒定

1.3.1 小鼠組織DNA提取 于3～4周齡時候剪取小鼠鼠尾約2 mm，并置于1.5 mL EP管中。加入100 μL鼠尾裂解液A液，100℃金屬浴加熱1 h；4 000轉離心5 min，吸取上清移入新的EP管中；加入鼠尾裂解液B液100 μL，振蕩混勻，制得DNA模板于-20℃保存備用。

1.3.2 PCR反應及瓊脂糖電泳和成像分析 利用DEPTOR基因和Cre基因的鼠特異性引物（表1A）進行PCR反應。DEPTOR基因PCR反應體系（20 μL）：Pcrmix 10 μL，引物各 2 μL（引物濃度為 10 μm），模板DNA 2 μL，加滅菌蒸餾水補足體積。反應條件為94℃預變性3 min，94℃變性30 s、57℃退火1 min、72℃延伸30 s，35個循環；最后72℃延伸2 min，4℃保存備用。Cre基因PCR反應體系（20 μL）：Pcrmix 10 μL，目的基因引物2 μL（引物濃度為10 μm）和內參引物1 μL（引物濃度為10 μm），模板DNA 2 μL，加滅菌蒸餾水補足體積。反應條件為第一階段94℃預變性2 min，94℃變性20 s、65℃退火15 s、68℃延伸10 s，10個循環；第二階段94℃變性15 s、60℃退火15 s、72℃延伸10 s，10個循環；第三階段72℃延伸2 min，10℃保存備用。兩種基因PCR反應終產物（6 μL/孔）進行2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統分析結果。

1.4 胰島β細胞DEPTOR基因敲除小鼠敲除效果驗證 對8周齡目的基因鼠（KO）和對照組鼠（Control）連續腹腔注射他莫昔芬（50 mg/kg）1周，于第12周時處死小鼠，取小鼠一部分胰腺組織提取RNA和總蛋白，剩余胰腺組織制成石蠟切片。按照常規QPCR、Western blot、免疫熒光步驟進行DEPTOR基因敲除效果的驗證。

2 結果

2.1 DEPTORloxp/loxp、Cre+/-和 DEPTORloxp/loxpCre+/-小鼠繁殖及鑒定情況 DEPTORloxp/loxp小鼠純合子自交繁殖，依據遺傳定律，其子代小鼠的基因型均DEPTORloxp/loxp純合小鼠，從引進開始繁殖10個月，共繁殖34只DEPTORloxp/loxp純合小鼠，子代小鼠皮膚及毛發均為黑色，部分子代小鼠基因型鑒定結果如圖1；Cre小鼠（黑色）和野生型C57小鼠（黑色）雜交，共獲得子代41只，其中重組酶Cre表達陽性的小鼠22只（占總數53.7%），部分子代小鼠基因型鑒定結果如圖2；DEPTORloxp/loxp與Cre小鼠雜交獲得F1代58只，其中F1代DEPTORloxp/-。Cre+/-鼠30只（占總數51.7%），部分子代小鼠基因型鑒定結果如圖 3；DEPTORloxp/-。Cre+/-鼠與 DEPTORloxp/loxp鼠雜交，共獲得F2代鼠43只，其中DEPTORloxp/loxp?Cre+/-10只（占總數23.3%），部分子代小鼠基因型鑒定結果如圖4。

圖1 DEPTORloxp/loxp小鼠基因型PCR鑒定結果Fig.1 PCR genotyping results of DEPTORloxp/loxpmice

圖2 表達Cre重組酶小鼠基因PCR型鑒定結果Fig.2 PCR genotyping results of Cre recombinase mice

圖3 F1代小鼠基因型PCR鑒定結果Fig.3 PCR genotyping results of the first?generation offsprings

2.2 QPCR、Western blot、免疫熒光驗證DEPTOR基因敲除效果 提取KO小鼠和Control小鼠胰腺組織RNA逆轉錄成cDNA，根據特異性引物（表1B）進行定量PCR檢測（QPCR），提取KO小鼠和Control小鼠胰腺組織蛋白進行Western blot檢測。由結果圖5可見，KO小鼠DEPTOR mRNA（A）與蛋白（B）表達水平低于Control小鼠，差異顯著（Mean±SD，n=3）。**P＜ 0.05；進一步驗證DEPTOR敲除效果是發生在胰島β細胞，進行免疫熒光雙標染色，結果如圖5可見DEPTOR基因主要表達在胰腺導管，但在胰島β細胞中也有表達，且DEP?TOR基因表達量Control小鼠（C圖）要明顯高于KO小鼠（D圖）。

圖4 F2代小鼠基因型PCR鑒定結果Fig.4 PCR genotyping results of the second?generation offsprings

圖5 QPCR、Western blot、免疫熒光(20 ×)驗證DEPTOR基因敲除效果Fig.5 QPCR、Western blot and Immunofluorescence(20 ×)were applied to identify the knockout effect of DEPTOR gene

表1 基因型鑒定（A）和QPCR（B）的引物信息Tab.1 Primer Information for genotyping（A）and QPCR（B）

3 討論

隨著對基因組學的研究深入，基因敲除技術的使用也越來越普遍，通過建立穩定的實驗動物基因敲除模型是研究基因功能的常規策略。本文所提及的條件性基因敲除是利用Cre/Loxp重組系統介導基因打靶的方法。Cre重組酶由Cre基因編碼，類似于一把基因剪刀，可識別特異DNA序列（如Loxp位點），可剪切掉Loxp位點之間的靶基因，從而達到靶基因敲除的目的。條件性基因敲除所指的是對Cre基因進行調控，在Cre基因插入特定的可被調控的啟動子序列，即可人為的控制Cre基因的表達，從而可以在時間和空間研究某個特定基因的功能。

在人體，DEPTOR基因位于第八號染色體，8q24，12，分子量 48 kDa，是一類在 mTORCl和mT0RC2均含有的結合蛋白，以其PDZ域與mTOR相互作用。DEPTOR作為mTOR家族的一個重要成員，對細胞代謝也有著重要的影響。在肌肉中，Baf60c能通過激活DEPTOR介導的Akt/PKB通道促進糖的有氧氧化向糖酵解的肌纖維類型轉變［5］。在肝臟，肝DEPTOR缺失改變空腹代謝轉變［6］。DEPTOR還通過激活Akt?PPAR?γ信號軸能促進白色脂肪組織生成［7］。此外，有研究顯示DEPTOR啟動子區域基因突變與肥胖的兒童和青少年患胰島素抵抗的發生風險顯著下降相關［8］。由于對DEPTOR基因與糖代謝及糖尿病的研究多集中在細胞及組織水平，缺乏整體動物水平上的研究。因此，構建DEPTOR基因敲除小鼠模型對進一步深入研究DEPTOR的功能極為重要。此外，β細胞的研究在糖尿病研究領域占據著不可動搖的主導地位。本實驗構建了條件性胰島β細胞DEPTOR基因敲除小鼠模型，可在不同的時間節點上在胰島β細胞對DEPTOR基因進行調控，能更進一步研究DEPTOR基因的功能。

綜上所述，本實驗利用Cre/Loxp重組系統成功構建了條件性胰島β細胞DEPTOR基因敲除小鼠模型，該小鼠和正常野生型小鼠在生長速度、繁殖能力等方面無明顯差異，在糖耐量上出現異常。這是國際上首次利用Cre/Loxp技術構建條件性胰島β細胞DEPTOR基因敲除小鼠模型，為進一步研究DEPTOR基因與糖尿病發生機制中扮演的角色提供了重要的動物模型。

參考文獻

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