利用體外合成的mRNA 編輯間充質干細胞對神經膠質瘤DBTRG 細胞殺傷作用

付紅霞 馬志鵬 儲承科 郭興榮十堰市太和醫院（湖北醫藥學院附屬醫院）檢驗科（湖北十堰 44000）；湖北醫藥學院附屬太和醫院胚胎干細胞研究湖北省重點實驗室（湖北十堰 44000）

神經膠質細胞瘤是最常見的顱內腫瘤，具有高發病率、高致死率等特點［1-2］。患者接受手術與化療后的中位生存時間僅2～3年。由于神經膠質瘤所具有細胞結構混雜、彌漫性的侵襲力、高耐藥性等特性，給研究者帶來了巨大的挑戰［3］。因此，急需開發安全高效的腦膠質瘤治療新方法，而生物治療是最有前景的方案之一。

基因治療是非常有潛力的生物治療方法之一。自MSCs的腫瘤歸巢性被發現后，以抗癌基因編輯MSCs介導治療腫瘤的研究越來越受到人們關注［4］。我們前期研究利用MSC介導的單一TRAIL［5］或 PTEN［6］基因均可促進膠質瘤細胞凋亡，但局限于攜帶單一抗癌基因所進行的腫瘤靶向治療的研究，在面對腫瘤多變性與個體差異性情況下，難以獲得良好的治療效果。為解決單基因抵抗問題，我們選取通過外源性通路導致腫瘤細胞凋亡的TRAIL基因和通過內源性通路導致細胞凋亡的PTEN基因組合作，構建MSC介導的雙基因共表達系統作用于腦膠質瘤，來研究其對膠質瘤細胞的殺傷作用。

傳統的基因編輯載體如病毒、DNA載體等由于轉染效率低及可能引起基因重組、突變等問題限制其臨床應用［7］。近年來，一種新的安全高效體外合成mRNA的基因治療方法吸引著研究者們的目光［8］。利用體外合成mRNA的方法已廣泛應用于在多能干細胞或體細胞的編程及誘導分化等方面［9-10］。

本文將采用體外制備TRAIL及PTEN基因的mRNA，共轉染入MSC中，使兩種抗癌蛋白共表達，協同高效殺傷腦膠質瘤細胞。本研究將為開發高效、安全的的腦膠質瘤基因治療提供策略，為今后的臨床應用多基因聯合靶向治療疾病打下基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞和培養條件 MSCs從人的胰腺組織內分離得到，體內增殖擴增的方法如前所述［11］。人神經膠質瘤細胞DBTRG?LUC購自ATCC，嚴格按照ATCC建議方法培養，其培養條件與MSCs保持一致。

1.2 PTEN-與TRAIL?mRNA體外合成 體外RNA合成過程如圖1A所示，人5′UTR的Kozak序列和3′UTR序列由公司合成，克隆到pcDNA3.3載體后命名為pcDNA 3.3?TOPOTA載體。限制性內切酶切開質粒后作為tail PCR的模板。利用MEGAscript T7試劑盒合成，將ARCA帽子類似物、三磷酸腺苷、GTP、5?甲基胞嘧啶和假尿嘧啶等37℃孵育5 h后，再用堿性磷酸酶37℃處理2 h去除5′?三磷酸。合成的RNA用Ambion MEGA clear spin columns純化然后測定濃度后保存使用。

1.3 PTEN-與TRAIL?mRNA轉染MSCs表達檢測 按TransIT?mRNA說明書操作，將mRNA用Opti?MEM基礎培養基稀釋，然后將Boost reagent和TransIT?mRNA試劑依次按順序加入上步溶液中，室溫孵育2 min后，加入含完全培養基的培養皿內。培養皿置于培養箱內，分別于6和12 h后檢測基因的表達情況。成功轉染相應mRNA的MSCs分別命名為MSC?TRAIL，MSC?PTEN和MSC?T+P。

1.4 間接共培養的方法檢測腫瘤細胞的活力0 d時，將DBTRG?LUC細胞以5 × 103個/孔的密度接種于96孔板中。1 d時將96孔板中培養基換為從 MSCs（CM）或轉染 PTEN mRNA、TRAIL mRNA或者共轉MSC的條件培養基（CM）（CM?PTEN、CM?TRTIL、CM?TRTIL/PTEN），按0%、25%、50%、75%和100%CM5種濃度梯度分別加入到100 μL MEM完全培養基中繼續培養。在第0、3、6天時利用小鼠活體成像儀檢測發光強度。

1.5 transwell共培養系統檢測MSCs的遷移能力 將DBTRG?LUC細胞按1×105個/孔接種到24孔板內，將野生型 MSCs、MSC?TRAIL、MSC?PTEN或MSC?TRTIL/PTEN用無血清的培養基混勻加到transwell小室的微孔膜上。培養48 h后，95%乙醇固定小室，0.1%結晶紫染色。100×顯微鏡下分別隨機選取5個視野記數穿過的細胞數。將上述的DBTRG?LUC細胞換為野生型MSCs重復實驗作為正常細胞的移能力對照。

1.6 熒光顯微鏡分析 0 d，將DBTRG?LUC細胞按1×105個/孔的密度接種到24孔板內。1 d時，將原培養基換為50%或者100%的CM。4 d時加入新鮮配置的工作液（含1 μmol/L calcein AM和2 μmol/L EthD?1，250 μL/孔）置于暗室中孵育 10 min。ImageJ處理分析熒光顯微鏡觀察的圖片。

1.7 統計學方法 利用SPSS 10統計學軟件，組間差異用兩樣本均數t檢驗，率的比較用χ2檢驗，以P＜0.05表示差異有顯著統計學意義。

2 結果

2.1 PTEN-與TRAIL?mRNA的體外合成及鑒定 mRNA合成流程如圖1A所示，以前期構建載體為模板構建具有分泌型信號肽的PTEN和TRAIL mRNA合成載體利用GFP?mRNA為對照檢測mRNA轉染效率，結果顯示GFP?mRNA轉染MSCs效率可高達98.6%（圖1B）。與對照組對比轉染組細胞中TRAIL和PTEN的蛋白表達量明顯增多，在培養基中也能檢測到分泌形式的TRAIL和PTEN蛋白（圖1C）。

2.2 轉染TRAIL、PTEN mRNA對MSCs遷移能力影響 經過48 h的間接共培養，transwell結果顯示，與野生 MSCs對比 TRAIL?和 PTEN?mRNA 的轉染并沒有降低MSCs向DBTRG細胞的遷移能力（圖2A），反而MSC?TRAIL、MSC?PTEN和MSC?TRAIL/PTEN的遷移能力明顯的增強（圖3C）。而對照組（小室底部沒有鋪DBTRG?LUC細胞）中以上各組細胞并未遷移（圖2B）。

活體成像儀檢測結果如圖3a所示，隨著CM比例提高和培養時間延長，DBTRG?LUC細胞的熒光強度逐漸降低。在CM（25%）時，共培養6 d后，DB?TRG?LUC細胞死亡率均顯著增高（P＜0.05）（圖3b1）；在共培養的第3天，CM（75%）的CM?TRTIL、CM（50%）的CM?PTEN和CM（25%）的CM?TRTIL/PTEN時已經開始有細胞死亡（P＜0.05）（圖3b2～4）。然而，RTCA實驗的結果顯示在加入CM 20 h后就對DBTRG?LUC細胞活力有影響（圖4）。

圖1 mRNA的體外合成與轉染表達情況Fig.1 mRNA synthesis and in vitro expression in MSCs

圖2 Transwell檢測MSCs遷移能力Fig.2 In vitro migratory ability of MSCs

利用LIVE/DAED Viability/Cytotoxicity Assay Kit分析CM對DBTRG?LUC細胞致死作用，在50%和100%CM培養DBTRG?LUC細胞4 d后，與正常MSC細胞的CM對比CM?PTEN、CM?TRTIL及CM?TRTIL/PTEN能顯著引起DBTRG?LUC細胞死亡（圖5）。

圖3 DBTRG?LUC細胞活力檢測Fig.3 Assessment of DBTRG cell viability using bioluminescence determination

圖4 利用RTCA實時分析CM對DBTRG細胞的殺傷作用Fig.4 Real?time assessment of conditioned medium（CM）?induced cytotoxicity in DBTRG cells

3 討論

惡性膠質瘤很難治愈，主要是由它的生長位置和容易遷移侵襲的特性決定的［12］。自從MSCs的腫瘤趨向性被發現以來，利用特定抗癌基因編輯的MSCs已逐漸成為最有潛力的靶向治療膠質瘤方法。然而，用病毒或質粒載體攜帶抗癌基因的MSCs不能應用于臨床治療。

最新的體外合成mRNA方法，是一種安全高效的基因治療方法，它可完全排除對宿主基因的修飾，并已被證實可應用于臨床研究［13］。因此，利用體外合成特定抗癌基因mRNA編輯MSCs的方法具有臨床應用價值。

腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體（TARIL）基因可以通過激活死亡受體促使腫瘤細胞凋亡而又不損傷正常細胞［14］，這使其成為抗腫瘤藥物結合的潛在靶點。幾乎所有腦膠質瘤患者都伴有PTEN基因表達活性的低下，高達40%的腦膠質瘤是由PTEN基因突變所致，以增強PTEN基因表達活性為手段的抗癌研究一直受到廣泛的關注［15］。鑒于此，我們體外合成能表達分泌TARIL、PTEN蛋白的mRNA，并用它們分別編輯MSC應用于治療癌癥研究，探討它潛在的臨床應用價值。

如圖1所示，體外合成的mRNA均得到了正確表達具有分泌性蛋白。并且體外合成的TARIL、PTEN mRNA不僅沒有降低MSCs的遷移能力，反而大大增加了它們對DBTRG細胞的遷移作用（圖2）。通過間接共培養方法發現，DBTRG細胞對CM?PTEN和CM?TRTIL非常敏感，用很低濃度的CM就可以在短時間內造成DBTRG細胞大量死亡，并且PTEN和TRAIL?mRNA聯合應用效果更明顯（圖3～4）。以上結果提示當單獨應用一種mRNA對腫瘤殺傷效果不明顯時，聯合應用多種mRNA也是提高療效的一種手段。

本研究利用體外合成抑癌基因TRTIL、PTEN mRNA修飾MSC作用于膠質瘤細胞，首次成功開拓了一種高效、安全、可靠雙基因共表達系統治療腫瘤新方法，為后期體內研究和臨床應用治療腫瘤提供了一種全新思路。然而TRTIL、PTEN雙基因共表達系統的高效殺傷腫瘤細胞的作用機制目前不是很清楚，以及在體內雙基因表達系統作用是否優于單基因作用效果，還需要進一步研究。

圖5 間接共培養分析DBTRG?LUC的活力檢測Fig.5 DBTRG?LUC cell viability of indirect co?cultures

參考文獻

［1］SIEGEL R L，MILLER K D，JEMAL A.Cancer statistics［J］.CA：a cancer journal for clinicians，2015，65（5）：5?29.

［2］徐濤，陳菊祥，盧亦成.RNA干擾在腦膠質瘤分子靶標研究中的進展［J］，實用醫學雜志，2010，26（8）：1143?1145.

［3］WESTPHAL M，LAMSZUS K.The neurobiology of gliomas：from cell biology to the development of therapeutic approaches［J］.Nature Reviews Neuroscience，2011，12（9）：495?508.

［4］MENON L G，KELLY K，YANG H W，et al.Human bone marrow?derived mesenchymal stromal cells expressing S?TRAIL as a cellular delivery vehicle for human glioma therapy［J］.Stem Cells，2009，27（12）：2320?2330.

［5］TANG X J，LU J T，TU H J，et al.TRAIL?engineered bone marrow ?derived mesenchymal stem cells：TRAIL expression and cytotoxic effects on C6 glioma cells［J］.Anticancer Res，2014，34（2）：729?734.

［6］YANG Z S，TANG X J，GUO X R，et al.Cancer cell?oriented migration of anticancer gene PTEN?engineered mesenchymal stem cell：an imaging demonstration［J］.Onco Targets Therapy，2014，7（10）：441?446.

［7］SANDERS N，RUDOLPH C，BRAECKMANS K，et al.Extra?cellular barriers in respiratory gene therapy［J］.Adv Drug Deliv Rev，2009，61（8）：115?127.

［8］LEONHARDT C，SCHWAKE G，STOGBAUER T R，et al.Single?cell mRNA transfection studies：Delivery，kinetics and statistics by numbers［J］.Nanomedicine，2013，13（5）：23?28.

［9］YOSHIOKA N，GROS E，LI H R，et al.Efficient generation of human iPSCs by a synthetic self?replicative RNA［J］.Cell Stem Cell，2013，13（21）：246?254.

［10］WARREN L，MANOS P D，AHFELDT T，et al.Highly effi?cient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA［J］.Cell Stem cell，2010，7（12）：618?630.

［11］ZHANG Z X，GUAN L X，ZHANG K，et al.Cytogenetic anal?ysis of human bone marrow?derived mesenchymal stem cells pas?saged in vitro［J］.Cell Biol Int，2007，31（18）：645?648.

［12］彭苗，丁穎，劉曉清，等.腦膠質瘤病22例臨床觀察和分析［J］.實用醫學雜志，2012，28（15）：2570?2572.

［13］WARREN L.Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modi?fied mRNA［J］.Cell Stem Cell，2010，7（2）：618?630.

［14］WU G S.TRAIL as a target in anti?cancer therapy［J］.Cancer Lett，2009，285（19）：1?5.

［15］平倩，張濤，陳玉，等.PTEN缺失在誘導大腸腺瘤樣息肉產生及惡性演變機制中的作用［J］.實用醫學雜志，2015，31（19）：3123?3125.