復元醒腦湯對糖尿病腦梗死模型大鼠梗死體積的影響及其分子機制研究

沈俊逸 趙智明 劉春麗 壯雨雯 徐文俊 蔡 輝

（南京軍區南京總醫院中西醫結合科，江蘇南京210002）

腦梗死因高發病率、高致殘率、高死亡率及高復發率與心臟病、惡性腫瘤組成人類的三大死亡病因，給人類的健康造成極大的威脅[1]。糖尿病并發腦梗死是糖尿病最常見的血管并發癥[2]。microRNAs是一類具有轉錄后調節活性的內源性單鏈小分子RNA，長約19～25bp，具有高度保守、非編碼、短序列等特性，在轉錄后階段調控相關靶基因蛋白質的表達。越來越多的研究結果顯示microRNAs與糖尿病的發生發展及預后轉歸密切相關[3-4]。miR-320還可以抑制血管生成，其抑制劑有可能成為一種治療糖尿病及其慢性并發癥的有效藥物。miR-320的靶點包括VEGF、bFGF、IGF-1及其受體IGF-1R在內的多種生長因子及其受體[5]。miR-320負性調控IGF-1及其受體IGF-1R，對糖尿病誘發的血管病變有重要影響。我們在前期研究中發現，中藥復原醒腦湯可以減輕胰島素抵抗，促進血管新生因子VEGF以及SDF-1、CXCR4的表達，促進血管新生，減少腦梗死體積[6-7]，但是復原醒腦湯對miR-320的表達以及相關靶點的影響還未得到證實。本研究制作糖尿病腦梗死大鼠模型，觀察復原醒腦湯對模型大鼠缺血腦組織miR-320以及IGF-1表達的影響，以期從microRNAs對基因表達調控作用途徑闡述復元醒腦湯促進糖尿病腦梗死缺血區血運重建的分子機制與有效作用靶點。

1 實驗材料

1.1 動物 150只健康雄性SD大鼠，體質量（250±25）g，購自上海杰思捷實驗動物有限公司，動物合格證號：SCXK（滬）2011-009。

1.2 藥物與試劑 TTC染色液（2%）購于上海遠慕生物科技有限公司；蛋白濃度BCA法測定試劑盒購于美國Thermo公司；肝素鈉、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、組織裂解液（RIPA）和ECL化學發光試劑盒購于上海市碧云天生物技術有限公司；Anti-IGF1抗 體，Anti-IGF1 Receptor抗 體 和Anti-GAPDH抗體購于美國abcam公司；RNA抽提試劑盒購于美國ZYMO RESEARCH公司；反轉錄試劑盒購于Takara公司（大連寶升生物）。復元醒腦湯，藥物組成：人參10g（單煎），三七10g，石菖蒲12g，水蛭10g，益母草30g，生南星15g，制大黃9g（后下），濃度388g/L，由上海中醫藥大學附屬龍華醫院藥劑科制備。

1.3 主要儀器 實時熒光定量PCR儀（Thermo Fisher，美國），化學發光成像系統（天能化學發光成像系統，Tanon-5200Multi），正置顯微鏡（OLYMPUS，日本），透射電鏡（日本電子，JEM-2000EX）。

2 實驗方法

2.1 分組與造模 將實驗大鼠按隨機數字表法隨機分為正常組、假手術組、模型組、西藥組、中藥組，每組30只。糖尿病模型制作：模型組、西藥組和中藥組大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）50mg/kg，隨后采用高糖高脂肪食物飼養2周復制糖尿病大鼠模型，連續1周測量血糖大于16.6mmol/L為造模成功。腦梗死模型制作：將3/0單股尼龍線，置于肝素鈉中浸泡；用10%水合氯醛（0.35mL/100g）麻醉大鼠，在頸部正中偏右側行豎直切口，剝離出右側頸總動脈（CCA）、頸內動脈（ICA）和頸外動脈（ECA）；結扎ECA起始端和CCA近心端，用眼科剪在CCA遠心端和近心端之間剪一個小口距離頸總動脈分叉5mm，經CCA插入3/0尼龍線至大腦中動脈起始段，深度為（18.5±0.5）mm；維持體溫（37.0±0.5）℃；用乙醚再次麻醉大鼠，術后2h把尼龍線輕拔退1cm，作為再灌注0h。正常組不作任何處理；假手術插線深度為10mm，余同造模大鼠。腦梗死造模死亡率為37%，根據評分Berderson（≥1）鑒定造模成功[8]，本實驗中動物處理方法符合動物倫理學標準。模型組、假手術組、西藥組和中藥組每組隨機挑選成模的15只大鼠，正常組也隨機挑選15只正常大鼠進行研究。

2.2 藥物干預 根據臨床經驗，參照陳奇主編《中藥藥理實驗方法學》依實驗動物與人體表面積比計算，中藥組每日按10.4g/kg體重給予復元醒腦湯灌胃，西藥組每日以二甲雙胍27mg/kg體重和尼莫地平2.16mg/kg體重灌胃，正常組、假手術組、模型組均給予等容量的生理鹽水灌胃，每日2次，連續14d。

2.3 檢測指標

2.3.1 腦梗死體積測定 各組大鼠治療14d后用10%水合氯醛腹腔注射深度麻醉（每組7只），放血，打開顱骨，取出完整的腦組織，用刀片將腦切成6片2mm左右厚度，用2%TTC染色液37℃中避光染色30min[9]，拍照并用ImageJ軟件分析各組大鼠腦組織梗死體積。

2.3.2 缺血腦組織病理形態學觀察 治療后每組取4只大鼠，深度麻醉后進行心臟灌流，斷頭取腦組織。每組2只大鼠進行腦組織HE染色，用多聚甲醛（4%）固定，進行組織梯度脫水，包埋，病理切片，染色和封片，于正置顯微鏡下觀察并拍照。每組另外2只大鼠進行透射電鏡觀察，將大鼠腦組織用2.5%戊二醛固定，樹脂包埋，超薄切片和染色，于透射電鏡下觀察腦缺血后皮質微血管超微結構的改變。

2.3.3 缺血腦組織miR-320基因表達水平及IGF-1、IGF-1R蛋白表達水平檢測 治療后各組大鼠取3只，用10%水合氯醛腹腔注射深度麻醉，快速斷頭冰上取腦，剪開顱骨取得腦組織。分離出腦梗死組織（正常組與假手術組取全腦組織），根據中心線位置一分為二，一半加入RNA抽提試劑進行組織勻漿，并抽提RNA，利用反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA。采用實時熒光定量PCR儀進行定量PCR（QPCR）檢測缺血腦組織miR-320、IGF-1、IGFR和GAPDH的基因表達水平。引物序列，MiR-320-F：ACACTCCAGCTGGGACTTAAACGTGGTTG TAC；MiR-320-R：TGTCGTGGAGTCGGCAATTC；IGF-1-F：ACTCGATAACTTTGCCAGAAGAG；IGF-1-R：TTCTTGTGTGTCGATAGGGGC；IGF-1R-F：TAGTGGGTGTGTTGCCACC；IGF-1R-R：TCCACCGTGTTGCAAGACTAG；內 參 基因GAPDH-F：ACTTTGGCATCGTGGAAGGG；GAPDH-R：TGCAGGGATGATGTTCTGGG。另一半腦梗死組織采用Western方法，加入組織裂解液（RIPA）進行腦組織勻漿，離心后（12000r/min，5min）用BCA試劑盒定量蛋白濃度，進行SDS-PAGE電泳，PVDF轉膜，4℃孵育一抗（IGF-1、IGF-1R）過夜，室溫孵育二抗1h，在化學發光成像系統下用ECL化學發光試劑盒顯影檢測缺血腦組織IGF-1、IGF-1R蛋白表達水平[9]。

2.4 統計學方法 實驗數據使用SPSS 16.0進行分析，各實驗組數據差異性均以（±s）表示，P＜0.01表示存在統計學差異，不同組之間的比較采用One-ANOVA分析，組內比較用LSD方法。

3 實驗結果

3.1 各組大鼠腦組織梗死體積比較 正常組織被染成紅色，梗死區域為蒼白色。從TTC染色圖片中可見，梗死范圍主要位于額葉、頂葉、部分顳葉皮質、背側丘腦、內囊和紋狀體等大腦中動脈支配區域，見圖1。正常組和假手術組大鼠的腦組織無梗死灶；模型組、西藥組和中藥組均有明顯的腦梗死病灶，其中西藥組和中藥組腦組織的梗死范圍均小于模型組。模型組腦梗死體積（175±19）mm3，西藥組腦梗死體積（148±21）mm3，中藥組腦梗死體積（132±15）mm3，正常組與假手術組腦梗死體積均為0。各組腦梗死體積比較，模型組和假手術組比較有極顯著性差異（P＜0.01），中藥組、西藥組大鼠腦梗死體積明顯小于模型組（P＜0.01），中、西藥組組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠腦組織梗死情況

3.2 各組大鼠腦組織病理形態學比較

3.2.1 HE染色 見圖2。正常組細胞排列整齊，細胞核居中，染色較深，數量較多，細胞質的染色較為均一，沒有出現細胞變性和壞死的現象。假手術組出現了細胞核固縮的現象，細胞質染色欠均勻，細胞有輕微損傷。模型組細胞之間的間隙增大，排列紊亂，細胞核固縮、破裂甚至消失，胞漿染色不均一，出現水腫現象，有明顯的細胞變性和壞死。西藥組和中藥組細胞排列趨向于規則、有序，細胞核固縮和彌散現象減弱，胞漿染色較模型組均勻，細胞損傷明顯得到改善。

圖2 各組大鼠腦組織病理改變（HE染色，400×）

3.2.2 透射電鏡觀察 見圖3。正常組腦皮質微血管的血管壁厚，電鏡下染色深，血管內皮細胞之間緊密連接，基底膜緊密連接。假手術組的血管連接比較緊密，細胞核染色較深，未出現明顯的細胞器損傷。模型組的細胞連接疏松，血管細胞壁比較薄，胞核彌散。西藥組、中藥組與模型組相比管壁相對增粗，血管內皮細胞的胞質水腫減輕，胞核彌散減輕，緊密連接逐漸恢復規則化，基底膜疏松減弱。

圖3 各組大鼠腦皮質微血管形態（Bar值為2μm）

3.3 各組大鼠缺血腦組織miR-320、IGF-1、IGF-1R基因表達水平比較 采用實時熒光定量PCR技術檢測各組大鼠缺血腦組織miR-320、IGF-1、IGF-1R基因表達水平，結果見表1。模型組與假手術組比較miR-320基因的表達水平顯著升高（P＜0.01），IGF-1 mRNA表達水平顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，西藥組和中藥組miR-320基因表達水平顯著降低（P＜0.01），IGF-1 mRNA表達水平顯著升高（P＜0.01）；中藥組、西藥組組間比較差異無統計學意義（P＞0.05）。可見缺血腦組織中miR-320表達上調，IGF-1的mRNA表達下調，而復元醒腦湯和西藥都能有效調節缺血腦組織中的miR-320基因和IGF-1 mRNA表達，中、西藥效果相近。與假手術組比較，模型組大鼠缺血腦組織IGF-1R mRNA表達無統計學差異（P＞0.05）。

表1 各組大鼠缺血腦組織miRNA-320、IGF-1、IGF-1R基因表達水平比較

3.4 各組大鼠缺血腦組織IGF-1、IGF-1R蛋白表達水平比較 采用Western blot分析方法檢測各組大鼠缺血腦組織IGF-1、IGF-1R蛋白表達水平，結果見圖4、表2。模型組IGF-1蛋白表達水平顯著低于假手術組和正常組（P＜0.01），西藥組和中藥組IGF-1的蛋白表達水平均顯著高于模型組（P＜0.01），中藥組顯著高于西藥組（P＜0.01）。可見缺血腦組織中IGF-1蛋白表達下調，經復元醒腦湯或西藥治療都能部分恢復其表達，中藥的療效顯著優于西藥。與假手術組比較，模型組IGF-1R的蛋白表達無統計學差異（P＞0.05）。

圖4 各組大鼠缺血腦組織IGF-1、IGF-1R蛋白表達

表2 各組大鼠缺血腦組織IGF-1、IGF-1R蛋白表達比較

4 討論

現代醫學認為糖尿病是腦梗死的一個獨立危險因素，糖尿病患者發生腦梗死的概率是非糖尿病患者的2～4倍。腦梗死發生的主要原因是動脈粥樣硬化，高血糖促進動脈粥樣硬化的發展，致使糖尿病患者腦動脈粥樣硬化發生率約為70%。此外，高血糖也可導致凝血系統的改變，促進血栓形成，引發并加重動脈粥樣硬化。尼莫地平為二氫吡啶類鈣離子拮抗劑，易透過血腦屏障，幾乎不影響外周血管，但能高度特異性作用于腦血管，抑制鈣離子進入血管平滑肌細胞，擴張腦血管，增加缺血腦組織的血液供應。尼莫地平可抑制鈣離子進入神經元，顯著降低神經元游離鈣水平，減輕鈣超負荷引起的神經元毒性損害，可有效地預防和治療腦血管痙攣引起的缺血性腦神經損傷。二甲雙胍具有獨立于降糖外的血管保護作用，通過對患者糖脂代謝的調節，使體內游離Ca2+濃度降低，通過刺激外周組織吸收葡萄糖，舒張血管平滑肌，有效改善胰島素抵抗，并可起到控制血壓的作用。臨床使用二甲雙胍聯合尼莫地平治療糖尿病腦梗死具有良好的效果。

中醫認為糖尿病并發腦梗死屬于“消渴并發中風”的范疇，多由元氣虛弱，腎元虧虛，形神俱傷，釀生痰瘀，致瘀阻脈絡，痰熱生風，治療中我們堅持以扶持元氣為主，聯合逐瘀化痰、泄熱息風通絡，擬復元醒腦湯。本方可以恢復機體平衡，扶正祛邪，使局部及整體的血氣調和，治療缺血性中風，在減輕腦水腫程度，改善神經功能恢復、胰島素抵抗以及調節血管內皮細胞生長因子VEGF的表達等方面取得顯著效果。本研究發現復元醒腦湯與西藥都具有良好的腦梗死治療效果，能夠顯著減少腦梗死體積，促進腦梗死區域血管新生和微循環的作用。機體在高血糖的狀態下，內皮細胞中miR-320的表達顯著增加[10]，IGF-l蛋白由于受miR-320的負調控而表達降低[11]。IGF-1是一種重要的神經保護多肽，IGF-1及其受體均廣泛分布于腦組織[12]，IGF-1在腦組織中的表達正常對于缺血腦組織神經的恢復有重要意義[13-14]。本研究結果表明，復元醒腦湯和西藥都能顯著提高梗死腦組織中IGF-1的表達量，顯著降低miR-320基因表達。

綜上，復元醒腦湯對糖尿病腦梗死模型大鼠腦梗死的改善作用可能與其降低miR-320的表達同時促進IGF-1的高表達有關。本研究豐富了復元醒腦湯治療糖尿病腦梗死在血管新生方面的機制，為進一步探索糖尿病腦梗死的病理機制、制定防治策略及新藥研發提供了一條全新的途徑。

參考文獻

[1]ROGER V L，GO A S，LLOYD-JONES D M，et al.Executive summary：heart disease and stroke statistics—2012 update：a report from the American Heart Association[J].Circulation，2012，125（1）：188.

[2]VAN ROOIJ E.The art of microRNA research[J].Circ Res，2011，108（2）：219.

[3]FENG B，CHAKRABARTI S.miR-320 Regulates Glucose-Induced Gene Expression in Diabetes[J].ISRN Endocrinol，2012：549875.

[4]AL-JAMAL K T，GHERARDINI L，BARDI G，et al.Functional motor recovery from brain ischemic insult by carbon nanotube-mediated siRNA silencing[J].Proc Natl Acad Sci USA，2011，108（27）：10952.

[5]張丹丹，沈靜，劉芳.微小RNA與糖尿病血管新生[J].國際內分泌代謝雜志，2013，33（1）：40.

[6]沈俊逸，方邦江，凌麗，等.復元醒腦湯對糖尿病腦梗死大鼠腦組織SDF-1、CXCR4、VEGF基因及蛋白表達作用的研究[J].中國中醫急癥，2016，25（8）：1457.

[7]方邦江，周爽，沈俊逸，等.復元醒腦湯對糖尿病腦梗塞大鼠胰島素抵抗干預作用的實驗研究[J].成都醫學院學報，2012，7（3）：374.

[8]劉恒濤.地黃飲子治療對腦缺血大鼠行為學評分的影響[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2017，15（2）：168.

[9]ZHANG L，GENG X，ZHOU J，et al.Fabrication of poly（γ-glutamic acid）-based biopolymer as the targeted drug delivery system with enhanced cytotoxicity to APN/CD13 over-expressed cells[J].J Drug Target，2015，23（5）：453.

[10]YAN H，MITSCHELEN M，TOTH P，et al.Endothelin-1-induced focal cerebral ischemia in the growth hormone/IGF-1 deficient Lewis Dwarf rat[J].J Gerontol A Biol Sci Med Sci，2014，69（11）：1353.

[11]SHANTIKUMAR S，CAPORALI A，EMANUELI C.Role of microRNAs in diabetes and its cardiovascular complications[J].Cardiovasc Res，2012，93（4）：583.

[12]LI C，CHE L H，SHI L，et al.Suppression of Basic Fibroblast Growth Factor Expression by Antisense Oligonucleotides Inhibits Neural Stem Cell Proliferation and Differentiation in Rat models With Focal Cerebral Infarction[J]. J Cell Biochem，2017，118（11）：3875.

[13]WANG X H，QIAN R Z，ZHANG W，et al.MicroRNA-320 expression in myocardial microvascular endothelial cells and its relationship with insulin-like growth factor-1 in type 2 diabetic rats[J].Clin Exp Pharmacol Physiol，2009，36（2）：181.

[14]ZHANG L，WANG T，LI Q，et al.Fabrication of novel vesicles of triptolide for antirheumatoid activity with reduced toxicity in vitro and in vivo[J].Int J Nanomedicine，2016，11：2663.