酵母抽提物對醬油醬醪液態發酵的影響研究

楊明泉

(廣東美味鮮調味食品有限公司，廣東 中山 528437)

醬油是以(脫脂)大豆和面粉、小麥粉為原料，經過米曲霉或醬油曲霉等微生物固態產生蛋白酶、淀粉酶和谷氨酰胺酶等酶系，并經細菌、酵母菌等微生物的長期液態發酵，形成的富有多種氨基酸和糖類的色香味俱佳的調味品[1，2]。目前，我國醬油的年產量已經超過600萬噸，占世界總產量的60%左右，是中國每家每戶佐餐的必需品。

酵母抽提物是以啤酒酵母或面包酵母為原料，利用酵母自身的酶或外加食品級酶制劑自溶或酶解(可在經分離提取)后得到的富含氨基酸、肽、多肽、核苷酸等鮮味劑的呈味基料。酵母抽提物鮮味和厚味突出，廣泛應用于調味品、方便食品、冷凍食品的調味[3]。近年來，酵母抽提物在醬油行業的應用成為了研究的熱點。如周朝暉等人發現醬油調配時添加酵母抽提物可賦予醬油醇厚底味,增強其鮮香味,使鮮、咸、甜更加協調適口[4]。周尚庭等人發現醬油生產后期使用1.0%的酵母抽提物KU012后,谷氨酸含量提升0.11 g/dL[5]。楊蘭等人發現醬油制曲時加入酵母抽提物可顯著提高醬油大曲的孢子數[6]。

迄今為止，酵母抽提物對醬油醬醪發酵的研究鮮見報道和研究。本研究在醬油醬醪發酵過程中添加不同含量的酵母抽提物，分析了醬油氨態氮、總氮、還原糖、總糖、分子量分布以及醬醪蛋白酶活力等理化指標的變化規律，并結合感官分析，探討酵母抽提物對醬油醬醪理化指標及呈味特性的影響，以期為高品質醬油的釀造提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 原料

滬釀3.042米曲霉曲精 (Aspergillusoryzae)：石家莊市鼎鑫釀造食品科學研究所；面粉、大豆豆粕、食鹽：購于廣州市華潤萬佳超市；酵母抽提物C-102：廣東巍微生物科技有限公司。

1.2 儀器

BP211D分析天平 德國賽多利斯公司；A300氨基酸分析儀 德國曼默博爾公司；600高效液相色譜儀 美國Waters公司；KDN-103F微量凱式定氮儀 上海纖檢儀器有限公司。

1.3 試劑

氫氧化鈉、硫酸、鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、甲醛、苯酚等試劑：來自阿拉丁試劑公司，均為分析純。

1.4 實驗方法

1.4.1 發酵工藝

將豆粕于121 ℃加熱20 min后，添加豆粕干重80%的水量對豆粕進行充分潤濕，125 ℃再次蒸煮18 min后，冷卻至40 ℃左右。將蒸料與面粉按4∶1混合均勻，添加原料干重0.04%的曲精。大曲放入霉菌培養箱30 ℃培養42 h。將曲重/鹽水為1/2.5與17%的鹽水混合均勻，添加不同發酵液重量的酵母抽提物，室溫下進行發酵，發酵周期為60天。

1.4.2 氨基酸態氮、總氮、還原糖、總糖和總酸的測定

參照尹文穎的方法。

1.4.3 肽分子量分布的測定

采用凝膠色譜法測定不同工藝發酵醬油的分子量分布，色譜條件如下：采用Waters 600高效液相色譜儀，TSK gel G2000SWXL凝膠分析柱(7.8 mm×300 mm),參照尹文穎的方法。

1.4.4 游離氨基酸的測定

使用德國曼默博爾公司的A300自動氨基酸分析儀，參考尹文穎的方法。使用曼默博爾公司提供的iControl 和iPeak軟件分析氨基酸結果，使用外標法計算各氨基酸濃度。

1.4.5 醬油感官評價

感官評定訓練及測定使用定量描述分析(QDA)方法[7]。實驗在(23±2)℃的感官評定室中進行，使用線性圖形標度，0～9分制(無感覺-閾值感覺-微弱-中等-強烈)。最后定量描述分析結果用雷達圖表示。

1.4.6 統計分析

3次實驗結果采用平均值±標準偏差表示，使用SPSS 16和Excel軟件進行數據分析。

2 結果與討論

2.1 酵母抽提物對醬油理化指標的影響

醬油的氨態氮、總氮、總糖、還原糖和總酸是醬油風味的重要指標[8,9]。在醬油液態發酵過程中添加不同量的醬油抽提物，對醬油原油的氨態氮、總氮、總糖、還原糖和總酸的影響見表1。

表1 酵母抽提物添加量對醬油理化指標(g/dL)的影響Table 1 Effect of yeast extract on the physico chemical indexes(g/dL) of soy sauce

由表1可知，酵母抽提物對醬油原油的總氮、總糖、還原糖和總酸無顯著影響，但發酵過程中酵母抽提物C-102添加量達到0.03%后，醬油氨態氮含量提高0.02 g/dL；酵母抽提物添加量達到0.05 g/dL后，醬油氨態氮含量顯著提高了0.04 g/dL。考慮到酵母抽提物C-102中氨態氮含量為4 g/100 g，酵母抽提物本身對醬油中氨態氮的影響幾乎可以忽略，這表明發酵過程中添加酵母抽提物可提高醬油氨態氮含量。

2.2 酵母抽提物對醬油分子量分布的影響

表2 酵母抽提物添加量對醬油分子量(%)分布的影響Table 2 Effect of yeast extract on the molecular weight(%) distribution of soy sauce

由表2可知，添加酵母抽提物后醬油的分子量隨酵母抽提物添加量的增加而呈下降趨勢。當酵母抽提物添加量為0.05%時，分子量>10000 Da的組分顯著下降，而分子量1000～3000 Da和<1000 Da的組分顯著增加(P<0.05)。這一數據與表1的趨勢相吻合，表明發酵過程中添加酵母抽提物可促進大豆蛋白和小麥面筋蛋白降解為游離氨基酸和寡肽。

醬油發酵過程中醬醪中耐鹽性細菌總數一般在105～106cfu/mL，主要包括酵母菌、乳酸菌、霉菌等。添加酵母抽提物可促進大豆蛋白和小麥面筋蛋白降解的原因可能與酵母抽提物能促進耐鹽性細菌產蛋白酶有關。為此，有必要進一步分析酵母抽提物對醬醪蛋白酶活力的影響。

2.3 酵母抽提物對醬醪蛋白酶活力的影響

米曲霉具有產生豐富的酶系的特點，包括蛋白酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶、氨肽酶和羧肽酶等，其中蛋白酶主要是中性蛋白酶，它們的作用主要是將原料中的蛋白質水解為小分子的肽類[10，11]。因此醬醪發酵過程中起主要作用的是中性蛋白酶。不同酵母抽提物添加量的高鹽稀態醬油發酵過程中中性蛋白酶活力的變化見表3。

表3 酵母抽提物添加量對醬醪蛋白酶(U/mL)的影響Table 3 Effect of yeast extract on the protease activity (U/mL) of soy sauce mash

由表3可知，醬醪中添加酵母抽提物可明顯提高不同發酵時間醬醪中性蛋白酶的活力，且隨著酵母抽提物添加量的增加呈上升趨勢。其中酵母抽提物添加量為0.05%時，醬醪蛋白酶活力增加最為明顯。發酵20天時，酵母抽提物添加量為0.05%時，醬醪蛋白酶活力與未添加相比，提高了60.8%；發酵30天時，醬醪蛋白酶活力與未添加相比，提高了19.8%；發酵60天時，醬醪蛋白酶活力與未添加相比，提高了22.3%；發酵90天時，醬醪蛋白酶活力與未添加相比，提高了10.3%。

2.4 酵母抽提物對醬油氨基酸組成的影響

醬油游離氨基酸的組成和含量是其滋味的關鍵因素。根據Kato和Zhao等[12，13]對氨基酸呈味的描述對氨基酸呈味特性的分類，將游離氨基酸分為呈鮮味、甜味、苦味、無味這4類。不同酵母抽提物添加量對醬油游離氨基酸組成的影響見表4。

表4 酵母抽提物添加量對醬油游離氨基酸組成(mg/mL)的影響Table 4 Effect of yeast extract on the amino acids composition (mg/mL) of soy sauce

由表4可知，添加酵母抽提物后，醬油游離氨基酸中鮮味氨基酸相對含量增加，甜味氨基酸相對含量降低，苦味氨基酸相對含量增加。具體而言，谷氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、精氨酸和天冬氨酸含量隨酵母抽提物含量的增加而增加，而谷氨酰胺和色氨酸含量隨酵母抽提物含量的增加而降低，其他氨基酸變化規律不明顯。

2.5 酵母抽提物對醬油感官評價的影響

醬油原油具有較為強烈的咸味、明顯的鮮味、一定的酸味，而甜味和苦味比較弱。醬油原油的鮮味主要來源于醬油中游離的谷氨酸和天冬氨酸，以及少量鮮味肽和琥珀酸等有機酸[14]。醬油原油的甜味主要由醬油中含有葡萄糖等糖類物質以及甜味氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺等。醬油原油中的酸味是以乳酸為主的有機酸類，還包括醋酸和檸檬酸等。食鹽是醬油咸味的唯一來源，但其咸味強度受其他呈味物質的影響。醬油原油的苦味主要來源于苦味氨基酸，如酪氨酸、亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸等以及少量的苦味肽。微量的苦味給醬油原油以醇厚感，是產生醬油原油特有風味的基礎之一[15]。因此，醬油原油的滋味特征的形成比較復雜，它是多種呈味物質之間相互協調、相互作用的結果。

圖1 不同酵母抽提物添加量發酵的醬油滋味感官評定Fig.1 Effect of yeast extract on the sensory evaluation of soy sauce

由圖1可知，添加酵母抽提物進行發酵后醬油原油的鮮味和甜味逐漸增加，其中酵母抽提物添加量為0.05%的醬油樣品增加最為明顯。此外，隨著酵母抽提物添加量的增加，醬油原油的苦味和咸味逐漸降低。

3 結論

醬油醬醪發酵過程中添加0.05%的酵母抽提物可顯著提高醬油原油的氨態氮含量，醬油原油中分子量>10000 Da的組分顯著下降，而分子量1000～3000 Da和<1000 Da的組分顯著增加(P<0.05)。

添加酵母抽提物后，醬油中游離氨基酸中鮮味氨基酸和苦味氨基酸相對含量增加，甜味氨基酸相對含量降低。

添加酵母抽提物進行發酵后醬油原油的鮮味和甜味逐漸增加，其中酵母抽提物添加量為0.05%的醬油樣品增加最為明顯。

參考文獻：

[1]尹文穎,崔春,陳玲,等.發酵溫度對高鹽稀態醬油原油品質的影響[J].食品工業科技,2014,35(2):154-157.

[2]尹文穎.不同固形物濃度對高鹽稀態醬油發酵影響的研究[D].廣州：華南理工大學,2015.

[3]Cui C,Qian Y,Sun W,et al.Effects of high solid concentrations on the efficacy of enzymatic hydrolysis of yeast cells and the taste characteristics of the resulting hydrolysates[J].International Journal of Food Science and Technology,2016,51(5):1298-1304.

[4]周朝暉.酵母抽提物對發酵醬油品質影響研究[J].中國調味品,2016,41(5):57-60.

[5]周尚庭,李沛,郭輝.谷氨酰胺酶和酵母抽提物對無添加醬油的品質提升研究[J].中國調味品,2016,41(5):45-50.

[6]楊蘭,高獻禮,崔春,等.酵母抽提物對醬油種曲培養的促進作用及工藝優化研究[J].中國調味品,2009,34(8):52-54.

[7]馬永強,韓春然,劉靜波.食品感官檢驗[M].北京:化學工業出版社,2007.

[8]Lioe H N,Takara K,Yasuda M.Evaluation of peptide contribution to the intense umami taste of Japanese soy sauces[J].Journal of Food Science,2006,71(3):277-283.

[9]徐歡歡,歐陽珊,尹文穎,等.混合制曲對釀造醬油理化特性的影響[J].食品與發酵工業,2012,38(7):82-85.

[10]Chutmanop J,Chuichulcherm S,Chisti Y,et al.Protease production byAspergillusoryzae,in solid-state fermentation using agro-industrial substrates[J].Journal of Chemical Technology & Biotechnology,2010,83(7):1012-1018.

[11]Guo J P,Ma Y.High-level expression,purification and characterization of recombinantAspergillusoryzaealkaline protease inPichiapastoris[J].Protein Expression & Purification,2008,58(2):301-308.

[12]Nishimura T,Kato H.Taste of free amino acids and peptides[J].Food Reviews International,1988,4(2):175-194.

[13]Zhao C J,Schieber A,G?nzle M G.Formation of taste-active amino acids,amino acid derivatives and peptides in food fermentations-a review[J].Food Research International,2016,89:39-47.

[14]Yang B,Yang H,Li J,et al.Amino acid composition,molecular weight distribution and antioxidant activity of protein hydrolysates of soy sauce lees[J].Food Chemistry,2011,124(2):551-555.

[15]Lioe H N,Apriyantono A,Takara K,et al.Low molecular weight compounds responsible for savory taste of Indonesian soy sauce[J].Journal of Agricultural & Food Chemistry,2004,52(19):5950-5956.