山西老陳醋發酵階段一株產酶芽孢桿菌的分離與鑒定

喬羽，于迪，范振宇，邢曉瑩，王如福*

(1.山西農業大學 食品科學與工程學院，山西 晉中 030801； 2.山西農業大學 園藝學院，山西 晉中 030801)

山西老陳醋是傳統的固態發酵食醋，在其整個發酵過程中，微生物種類豐富，其生長代謝產生多種酶，對于山西老陳醋整個釀造過程至關重要。依據其催化機理分為淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等[1]。淀粉酶主要是利用原料中的淀粉生成葡萄糖；纖維素酶可將原輔料中的纖維素分解為微生物發酵可利用的糖，同時分解植物的細胞壁，使細胞中的淀粉、蛋白質等大分子物質流出，更容易被微生物利用[2-7]；蛋白酶可以分解原輔料中的蛋白質，供微生物生長繁殖利用，同時也在一定程度上形成一些風味物質。因此，淀粉酶、纖維素酶和蛋白酶對山西老陳醋的最終產量和品質具有重要的影響。

芽孢桿菌能產生包括淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶等在內的多種酶類。枯草芽孢桿菌產生淀粉酶、蛋白酶的能力已在工業生產中得到應用[8,9]。芽孢桿菌在大曲和整個發酵過程中始終存在，這可能是由于其極強的抗逆性[10,11]。因此產酶芽孢桿菌合理的應用對提高老陳醋品質具有重要意義。

本研究跟蹤山西老陳醋的發酵過程，從不同發酵天數的酒醪和醋醅中分離能夠產淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶的芽孢桿菌；篩選出高產酶的優勢菌株。后續可將其應用于山西老陳醋的發酵階段，為提高老陳醋的還原糖含量、氨基酸態氮含量及最終產品品質提供寶貴的菌種資源基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗樣品

樣品：取自山西某醋廠；酒醪：山西某醋廠，發酵時間為1，4，7，10天；醋醅：發酵時間為1，3，5，7，9天。每個樣品3份，置于4 ℃冰箱保存，備用。

1.1.2 試驗試劑

碘、碘化鉀、孔雀石綠、番紅、無水葡萄糖、可溶性淀粉、干酪素、L-酪氨酸、羧甲基纖維素納、剛果紅、氯化鈉、福林酚試劑、鹽酸、碳酸鈉、三氯乙酸。

1.1.3 培養基

營養瓊脂培養基：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化鈉5 g、瓊脂15 g，定容至1000 mL，121 ℃滅菌20 min，備用。

種子培養基：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g 、氯化鈉5 g，定容至1000 mL，121 ℃滅菌20 min，備用。

淀粉水解培養基：可溶性淀粉2 g、牛肉膏5 g、蛋白胨10 g、瓊脂粉20 g、氯化鈉 5 g，定容至1000 mL，121 ℃滅菌20 min，備用[12]。

酪素培養基：分別配制A液和B液，A液：Na2HPO4·7H2O 1.07 g，干酪素5 g，加適量蒸餾水，并加熱溶解；B液：KH2PO40.36 g，加水溶解。A液和B液混合后加瓊脂20 g，定容至1000 mL，121 ℃滅菌20 min，備用[13]。

羧甲基纖維素鈉培養基：磷酸氫二鉀0.5 g、(NH4)2SO42 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、微晶纖維素粉1.88 g、剛果紅0.2 g、瓊脂18 g，定容至1000 mL，121 ℃滅菌20 min[14]。

改良淀粉酶發酵培養基：高粱粉5.0 g、可溶性淀粉5 g、酵母膏5 g、蛋白胨10 g、葡萄糖1 g、KH2PO42 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、CaCl2·2H2O 0.2 g，定容至1000 mL，121 ℃滅菌20 min，備用[15]。

改良蛋白酶發酵培養基：黃豆粉20.0 g、高粱粉10.0 g、蛋白胨2.0 g、KH2PO41.5 g、K2HPO41.5 g、(NH4)2SO41.5 g、CaCl20.3 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、NaCl 2.0 g、葡萄糖5.0 g、蒸餾水1000 mL，121 ℃滅菌20 min，備用[16]。

改良纖維素酶發酵培養基：高粱粉5.0 g、CMC-Na 10 g、KH2PO42 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、蛋白胨 5 g、酵母粉5 g，定容至1000 mL，121 ℃滅菌20 min，備用[17]。

1.2 儀器與設備

SPX-100B-Z生化培養箱 北京瑞科中儀科技有限公司；BPX-272電熱恒溫培養箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；Neofuge 23R臺式高速冷凍離心機 上海力申科學儀器有限公司；2100型分光光度計 大尼科(上海)儀器有限公司；LEICA DM750生物顯微鏡 德國徠卡顯微系統有限公司；ZQPL-200立式全溫振蕩培養箱 天津萊玻特瑞設備有限公司；Centrifuge 5424R低速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；DYY-6C型電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 產酶芽孢桿菌的初篩

稱取10 g不同發酵天數的酒醪、醋醅樣品置于裝有90 mL無菌水的三角瓶中，80 ℃水浴加熱10 min富集芽孢桿菌，對富集液進行10倍梯度稀釋；吸取100 μL不同稀釋倍數的菌懸液分別涂布至淀粉水解培養基、酪素培養基和羧甲基纖維素鈉培養基上，每個梯度做3個平行；37 ℃恒溫培養48 h。淀粉水解培養基中加入一定量的盧氏碘液染色，即可看到水解圈的情況，酪素培養基和羧甲基纖維素鈉培養基可直接觀察透明圈的大小。

選取初篩培養基中有明顯水解圈的單個菌落，編號。采用分區劃線法連續純化3代后，固體斜面4 ℃保存備用。將已純化的芽孢桿菌分別再次接于淀粉水解培養基、酪素培養基和羧甲基纖維素鈉培養基上，37 ℃培養48 h后，用游標卡尺分別測量水解圈直徑(D)和菌落直徑(d)，計算兩者比值(D/d)大小，初步確定產酶活力的高低并挑選出比值較大的菌株。

1.3.2 產酶芽孢桿菌的復篩

將初篩得到的菌株挑取1環接種于種子培養基中，30 ℃搖床培養24 h。按照 2%的接種量分別接種于50 mL發酵培養基中，37 ℃ 180 r/min搖床培養48 h后，8000 r/min離心10 min，收集上清液為待測粗酶液。

淀粉酶活力測定:采用DNS測其淀粉酶活力[18]。酶活力單位定義：在40 ℃、pH值為3.7的條件下，1 mL酶液每1 min水解可溶性淀粉產生1 μg葡萄糖為1個酶活力單位(U/mL)。

酸性蛋白酶活力測定:按照國家標準SB/T 10317-1999 對各菌株發酵液中蛋白酶活力進行測定[19]。酸性蛋白酶酶活力單位定義為1 mL酶液在40 ℃、pH值為3.0的條件下，每1 min酪蛋白產生1 μg酪氨酸為1個酶活力單位(U/mL)。

纖維素酶活力測定:按照文獻[20]中方法對各菌株發酵液中纖維素酶活力進行測定。纖維素酶活力單位定義為1 mL酶液在38 ℃ 1 min水解羧甲基纖維素產生1 μg葡萄糖為1個酶活力單位(U/mL)。

1.4 高產酶菌株的鑒定

形態學鑒定：對菌株的菌落形態和細胞形態進行觀察。

生理生化鑒定：參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》第8版中芽孢桿菌屬特征和東秀珠的《常見細菌系統鑒定手冊》進行部分生理生化特性鑒定[21,22]。

分子生物學鑒定：采用16S rDNA鑒定。利用細菌基因組DNA快速抽提試劑盒對菌株的基因組DNA進行提取，采用細菌16S rDNA通用引物，以菌株的DNA基因組為模板。PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.2 min，30次循環；72 ℃延伸7 min。取4 μL的PCR產物于2%瓊脂糖凝膠中進行電泳。將擴增成功的PCR 產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，得到的序列在GenBank數據庫中進行Blast比對，下載同源性高的序列，利用Mega 6.0軟件構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 產酶的芽孢桿菌的篩選

從醋廠采集的不同發酵天數的酒醪和醋醅9份樣品中，分離純化得到60株產淀粉酶的芽孢桿菌，50株產蛋白酶的芽孢桿菌，48株產纖維素酶的芽孢桿菌。所篩選菌株產淀粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶菌株的部分透明圈平板情況見圖1。

圖1 所篩選菌株產淀粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶菌株的部分透明圈平板Fig.1 Part of transparent circle plates of strains for producing amylase, acid protease and cellulase

通過計算透明圈和菌落生長直徑的比值，挑選出6株D/d比值大于8的產淀粉酶的芽孢桿菌，6株D/d比值大于5的產蛋白酶的芽孢桿菌，6株D/d比值大于5的產纖維素酶的芽孢桿菌，見表1。

表1 產酶菌株的初步篩選Table 1 Preliminary screening of enzyme-producing strains

由表1可知，菌株JT10-9，CD92-3，JX4-13的水解圈直徑和菌落直徑比值較大，說明其產酶的能力相對較高。

2.2 產酶菌株的復篩結果

測定初篩得到的18株芽孢桿菌的發酵液中淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶酶活力，并對每株菌產酶情況進行綜合評分(淀粉酶酶活力占50%，蛋白酶酶活力和纖維素酶酶活力各占25%)，結果見表2。

表2 初篩菌株淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶酶活力Table 2 The activities of amylase, protease and cellulase of preliminary screened strains

由表2可知，綜合淀粉酶活力、酸性蛋白酶活力和纖維素酶活力，菌株JX4-13的綜合評分最高，因此篩選菌株JX4-13作為目的菌株并對其進行鑒定。

2.3 菌株個體及菌落形態觀察結果

綜合菌株的初篩和復篩結果，選取綜合評分最高的菌株JX4-13作為目標菌株。對菌株JX4-13進行了個體形態和菌落形態的觀察，見圖2。

圖2 菌株 JX4-13 的菌落特征及細胞形態Fig.2 Colony characteristics and cell morphology of strain JX4-13

由圖2可知，菌株JX4-13的菌體形態為桿狀，革蘭氏染色陽性，芽孢端生，孢囊不膨大。菌落呈乳白色，菌落直徑為2.10～2.90 mm，圓形或近圓形，表面干燥，不透明。

2.4 生理生化特征鑒定結果

表3 菌株JX4-13生理生化鑒定結果Table 3 Physiological and biochemical identification results of strain JX4-13

注：表中“+”表示該項目指標為陽性或生長；“-”表示該項目指標為陰性或不生長。

由表3可知，菌株JX4-13的生理生化特征與《常見細菌系統鑒定手冊》中芽孢桿菌屬特征相符，進一步確定菌株JX4-13屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)。

2.5 16S rDNA鑒定結果

菌株JX4-13 16S rDNA電泳結果見圖3。

圖3 菌株JX4-13 16S rDNA電泳結果Fig.3 PCR results of JX4-13 16S rDNA gene

以細菌基因組為模板，經過PCR擴增后，由圖3可知，菌株的PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測出大約在1400 bp處存在一條特異性條帶。測序獲得PCR產物為1395 bp長度的序列。將序列輸入到GenBank 數據庫中通過Blast比對進行同源性比較，并從GenBank選取芽孢桿菌屬的不同菌株，利用Mega 6.0軟件構建系統發育樹，見圖4。

圖4 菌株JX4-13的系統發育進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of JX4-13

由圖4可知，菌株JX4-13在系統發育上與Bacillussubtilis同屬于一個分支，置信度為99%。通過Blast比對，與Bacillussubtilis16S rDNA的同源性高達99%以上。因此，結合菌株JX4-13的菌落形態、細胞形態、生理生化鑒定結果，確定菌株JX4-13為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

3 結論

本試驗對山西老陳醋發酵階段產淀粉酶、酸性蛋白酶和纖維素酶的菌株進行了分離篩選；通過涂布淀粉、酪素和羧甲基纖維素鈉初篩平板及酶活力測定，獲得1株能夠產淀粉酶、酸性蛋白酶和纖維素酶且酶活力較高的菌株JX4-13。對菌株JX4-13的菌落形態、細胞形態、生理生化鑒定結果以及 16S rDNA鑒定結果，最后得出菌株JX4-13為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

菌株JX4-13分離自老陳醋發酵過程中，可適應山西老陳醋發酵環境，比加入酶制劑，從酒醪、醋醅中分離出的土著菌株更容易融入整個發酵過程。后續可繼續研究利用該菌株強化大曲或者混菌發酵應用到發酵過程中，這將為提高對原輔料中淀粉、蛋白質和纖維素的分解利用，改善老陳醋風味，提升老陳醋產品品質奠定理論基礎。

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