不同大豆品種在萌發期對干旱脅迫的生理響應及抗旱性評價

趙振寧，趙寶勰

(白銀市農業科學研究所， 甘肅 白銀 730900)

隨著全球性氣候變暖，干旱缺水已經成為發展農業生產的主要限制因素。我國有45%的國土面積處于西部干旱或者半干旱地區，該地區降水量少、年內分配不均、空氣干燥、地表蒸發量大，給主要農作物生產帶來了嚴峻的挑戰[1]。大豆(Glycinemax(L.) Merr)是我國重要的糧油兼用作物，營養價值高，是人類食物中植物蛋白質的主要來源。同時，大豆也是耗水量較大的作物，生育期內水分虧缺影響大豆正常生長發育及產量形成。因此，篩選大豆抗旱種質資源、培育抗旱節水品種被認為是發展干旱半干旱地區大豆生產的有效措施。

國內學者們在大豆不同生長發育時期抗旱性評價方面做了大量的工作，并篩選出一批抗旱種質資源[2-7]。種子萌發是植物整個生活史中的關鍵階段，也是進行抗旱性研究的重要時期，萌發期遭遇干旱脅迫會影響出苗，最終造成產量損失。目前，萌發期抗旱性評價主要采用室內PEG溶液模擬干旱法，該方法具有周期短、容量大、重復性強以及受其它環境因子影響小等優點[8]，已廣泛應用于小麥(TriticumaestivumL.)[9-10]、玉米(ZeamaysL.)[11-12]、水稻(OryzasativaL.)[13-14]及大豆[15-16]等主要農作物萌發期抗旱性評價研究中。王利彬等[17]研究發現利用15% PEG-6000對大豆品種萌發期抗旱性鑒定指標影響明顯，并在該濃度下將91份大豆種質資源劃分為耐旱、較耐旱、中間型、干旱較敏感型以及干旱敏感型5大類；肖佳雷等[5]采用20% PEG-6000對78份大豆種質進行萌發期抗旱鑒定，篩選得到黑河53、合豐45、合豐48、綏農22及綏農30等5份抗旱種質；舒英杰等[18]以抗旱性不同的3個大豆品種為材料進行大豆發芽期耐旱性鑒定，認為室內采用PEG-6000浸種法模擬干旱脅迫鑒定大豆發芽期耐旱性的適宜濃度為20%～25%。可以看出，上述研究中所使用的PEG濃度(滲透壓)不盡一致，即便在同一作物中也有所不同。因此，篩選出穩定、可靠的PEG處理濃度、建立切實可行的評價體系是進行萌發期抗旱評價的首要工作。

本試驗通過分析不同濃度PEG-6000對3個大豆品種萌發相關指標的影響，確定了用于抗旱評價的最佳濃度，并在該濃度下研究了PEG-6000模擬干旱脅迫對不同大豆品種生理生化指標的影響，最后采用隸屬函數法對3個品種的抗旱性進行綜合評價，以期為大豆種質萌發期抗旱性鑒定評價體系建立以及抗旱新品種選育提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料培養與處理

大豆品種黃豆(野生種)、晉豆19、鄭9007種子由甘肅省農業科學院國家農作物種質資源平臺-甘肅子平臺提供。挑選大小均勻一致、籽粒飽滿的干凈大豆種子，用0.5%次氯酸鈉溶液消毒10 min，其間不斷晃動，蒸餾水沖洗三遍后用無菌濾紙吸干，播于底部覆有雙層無菌濾紙的直徑為15 cm的培養皿中，每皿30粒，分別加入12%、14%、16%、18%及20%的PEG-6000溶液25 mL，并以無菌蒸餾水作為對照，置于溫度為25℃、濕度為(65±2)%的智能人工氣候培養箱(RTOP-150B，浙江托普儀器有限公司)中進行萌發試驗。每個處理設3次重復，每天稱重并補充蒸發的蒸餾水以維持溶液滲透勢的恒定。

1.2 測定方法

1.2.1 生長指標的測定 胚芽長度超過種子長度時視為發芽，第3 d開始每天統計發芽種子數。發芽率(%)=(發芽試驗期間全部正常發芽數/供試種子數)×100%，發芽勢(%)=(第4 d正常發芽的種子粒數/供試種子數)×100%。萌發試驗第7 d，每個培養皿隨機抽取10株測量胚根長。

1.2.2 生理指標的測定 分別取經18%的PEG-6000溶液和蒸餾水培養7 d的胚根，蒸餾水沖洗干凈后吸干水分用于測定SOD、POD及CAT活性、可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸及丙二醛含量。其中，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑光化還原法[19]，以抑制NBT光化還原50%所需酶量為1個酶活單位(U·g-1FW)；過氧化物酶(POD)活性采用愈創木酚法測定[19]，以每分鐘OD值變化0.01為1個酶活單位(U·min-1·g-1FW)；過氧化氫酶(Catalase, CAT)活性測定采用紫外分光光度計法[20]，以每分鐘OD值變化0.01為1個酶活性單位(U·min-1·g-1FW)；可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法測定[20]；可溶性蛋白含量測定采用考馬斯亮藍染色法測定[20]；脯氨酸含量的測定采用Troll等方法[21]；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸比色法測定[22]。

1.3 數據處理

采用Microsoft Excel 2013和Origin8.5軟件進行數據處理和繪圖，采用SPSS 16.0統計分析軟件對數據進行方差分析及最小顯著差異性檢驗(Duncan’s新復極差法，P<0.05)。參照裴帥帥等[23]的方法進行基于隸屬函數法的綜合評價，首先計算各指標的相對值(PEG處理與正常條件下的比值)，然后計算其隸屬函數值，并求其平均值作為抗旱性評價的依據。隸屬函數計算公式為：

U(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(1)

U(Xi)=1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(2)

其中，Xi為某一指標第i個品種的相對值；Xmin為某一指標的最小值；Xmax為某一指標的最大值。如果某一指標與抗旱性為正相關，用(1)式計算，反之，則用(2)式。

2 結果與分析

2.1 不同濃度PEG處理對3個大豆品種種子萌發相關指標的影響

隨著PEG濃度的不斷增加，3個大豆品種的相對發芽勢、相對發芽率以及相對胚根長都呈現不同程度的下降趨勢(表1)。在PEG濃度12%～14%之間時，3個大豆品種的相對發芽勢、相對發芽率、相對胚根長均無顯著差異(P>0.05)，當PEG濃度增加到16%時，3個品種的相對發芽勢和相對胚根長仍無顯著差異(P>0.05)，但黃豆和鄭9007的相對發芽率顯著高于晉豆19(P<0.05)。當濃度在18%～20%之間時，3個品種之間的相對發芽勢、相對發芽率以及相對胚根長均差異顯著(P<0.05)。由此可見，在18% PEG模擬干旱脅迫下，3個品種的萌發相關指標的差異明顯。

表1 不同濃度PEG-6000處理對3個大豆品種萌發及胚根生長的影響

注：不同小寫字母表示各品種間的差異達到顯著水平(P<0.05)，下同。

Note: Different small letters meant significant difference among treatments at 0.05 level. The same below.

2.2 PEG模擬干旱脅迫對3個大豆品種抗氧化酶活性的影響

SOD、POD和CAT是植物體內重要的抗氧化酶，其中SOD可以催化超氧陰離子(O2·)轉化為過氧化氫(H2O2)，POD和CAT將H2O2轉化為H2O，它們在植物體清除過量ROS的生物過程中發揮著關鍵作用[24]。從圖1中可以看出，在18% PEG-6000處理使3個大豆品種的SOD、POD及CAT活性發生了顯著變化，在正常環境(CK)下，3個品種胚根SOD、POD及CAT活性均處于較低水平，18% PEG-6000處理下，3個品種(黃豆、晉豆19和鄭9007)胚根SOD活性分別上升為CK的5.41、3.54和4.30倍，POD活性上升為CK的2.13、1.58和1.52倍，CAT活性上升為CK的2.64、2.41和1.98倍。通過多重比較發現，18% PEG-6000處理下3個品種胚根中SOD活性大小依次為黃豆>鄭9007>晉豆19，其中黃豆與晉豆19和鄭9007相比差異顯著(P<0.05)，而晉豆19和鄭9007相比差異不顯著(P>0.05)；3個品種POD和CAT活性大小依次為黃豆>晉豆19>鄭9007，其中，黃豆與鄭9007和晉豆19相比差異顯著(P<0.05)，而鄭9007和晉豆19相比差異不顯著(P>0.05)。由以上結果可知，盡管18% PEG-6000使3個品種SOD、POD及CAT活性發生了明顯變化，且黃豆在干旱脅迫下3種抗氧化酶活性的增長倍數明顯高于晉豆19和鄭9007，說明黃豆與晉豆19和鄭9007相比可能具有更強的抗旱能力。

2.3 PEG模擬干旱脅迫對3個大豆品種滲透調節物質含量的影響

植物體內可溶性糖、可溶性蛋白及脯氨酸是重要的滲透調節物質，可以降低細胞的滲透勢，保護細胞膜結構的完整性，在干旱逆境條件下這類物質可以提高植物的抗逆能力，也是評價植物抗旱性的重要生化指標[25-26]。由圖2可知，3個大豆品種在正常條件(CK)下的可溶性糖、可溶性蛋白及脯氨酸含量相對穩定，品種間的差異不明顯，在18% PEG處理下，3個大豆品種(黃豆、晉豆19和鄭9007)可溶性糖含量分別上升為CK的2.84、2.60和2.56倍，可溶性蛋白含量上升為CK的2.13、1.42和1.10倍，脯氨酸含量上升為CK的10.98、6.74和8.90倍。相比而言，在18% PEG-6000處理下，3個品種可溶性糖、可溶性蛋白的積累量從大到小依次為黃豆>晉豆19>鄭9007，脯氨酸的積累量從大到小依次為黃豆>鄭9007>晉豆19，可以看出，在干旱脅迫下，黃豆與晉豆19、鄭9007相比積累了更多的滲透調節物質，可能具有較強的抗旱性。

圖1 PEG脅迫對三個大豆品種萌發期SOD、POD及CAT活性的影響

Fig.1 Effect of PEG stress on activities of SOD, POD and CAT of three soybean varieties during germination

2.4 PEG模擬干旱脅迫對3個大豆品種丙二醛含量的影響

在正常生長環境中，植物體內活性氧的產生與清除處于動態平衡狀態，當植物遭受脅迫環境時這種平衡會被打破，導致H2O2、超氧陰離子(O2·)等活性氧(ROS)大量積累，并造成膜質過氧化產物MDA大量生成[27]。從圖3中可以看出，正常條件下3個品種的MDA含量處于較低水平，但品種之間存在顯著差異，在18% PEG-6000處理下，3個品種MDA含量分別升高為CK的1.59、3.24倍和2.85倍，脅迫下的MDA含量從小到大依次為黃豆<晉豆19<鄭9007，可見在干旱脅迫下，黃豆的膜脂受傷害程度明顯小于晉豆19和鄭9007。

圖2 PEG脅迫對三個大豆品種萌發期滲透調節物質含量的影響

圖3 PEG脅迫對三個大豆品種萌發期丙二醛含量的影響

Fig.3 Effect of PEG stress on contents of MDA of three soybean varieties during germination

2.5 PEG模擬干旱脅迫下3個大豆品種耐受性指標隸屬函數值及綜合評價

抗旱性是復雜的數量遺傳性狀，單一指標評價品種抗旱能力存在片面性，通過計算各指標的相對值，進而計算隸屬值，取某一品種各指標的隸屬值的平均值進行綜合抗旱評價，結果發現，黃豆、晉豆19和鄭9007的抗旱性強弱依次為黃豆>鄭9007>晉豆19，由此可見，大豆野生種黃豆的抗旱能力遠遠大于育成品種晉豆19和鄭9007，利用野生種黃豆進行大豆抗旱遺傳改良具有可行性。

表2 3個大豆品種耐旱指標隸屬函數值及綜合評價

3 討 論

干旱是影響作物生長發育的常見非生物脅迫因素，因干旱造成的作物產量損失等于其它脅迫造成的產量損失之和[7]。在全球氣候變化的背景下，研究大豆的抗旱性鑒定評價技術，對于篩選抗旱種質、培育節水品種以獲高產穩產有重要意義。相比而言，提高大豆在萌發期的抗旱能力可以有效提高大豆在播種后的出苗率，可以有效提高干旱半干旱地區的大豆產量。目前，關于大豆萌發期抗旱性評價研究多使用室內PEG溶液模擬干旱脅迫，存在鑒定評價指標和PEG濃度不統一的問題。本研究中18% PEG-6000溶液處理能夠區分3個品種之間的差異，可作為大豆萌發期抗旱性評價的PEG處理濃度。

大豆抗旱性的遺傳基礎復雜，依靠單一的萌發指標難以評價其抗旱能力，采用多個形態及生理指標進行綜合評價可反映品種真實的抗旱水平[7]。SOD、POD及CAT在植物抵御干旱逆境反應中發揮著關鍵作用[28]。本研究發現，在18% PEG-6000干旱脅迫下，3個大豆品種SOD、POD及CAT活性與CK相比明顯升高，同時，黃豆SOD、POD和CAT活性明顯高于晉豆19和鄭9007(P<0.05)，但晉豆19和鄭9007之間差異不顯著(P>0.05)，說明大豆野生種黃豆相比而言可能具有較強的抗旱能力，這與綜合評價結果一致。滲透調節也是植物應對干旱脅迫的重要機制，干旱脅迫下，滲透調節物質含量的增加有助于維持細胞膨壓，將水勢維持在一定的水平，使細胞的正常生理代謝得以正常進行，脯氨酸等滲透調節物質對細胞內的ROS有直接的清除作用[29-30]。本研究中，干旱脅迫使3個品種的可溶性糖、可溶性蛋白以及脯氨酸含量均明顯增加，這與許興[31]、李樹華[32]等的研究結果一致。在3個大豆品種中，黃豆的可溶性糖、可溶性蛋白及脯氨酸含量明顯高于晉豆19和鄭9007，說明黃豆的抗旱性較強。MDA是細胞膜脂過氧化的產物，其含量的高低在一定程度上反映了植物在干旱脅迫下的受傷害程度，3個品種的MDA含量從小到大為黃豆<晉豆19<鄭9007，說明黃豆在干旱脅迫下的受傷害程度較小，可能具有較強的抗旱能力。

隸屬函數分析提供了一條在多指標測定基礎上對材料特性進行綜合評價的途徑，將它應用于抗旱育種的選擇，可以大大提高抗旱性篩選的可靠性，已經廣泛應用于農作物抗逆性綜合評價[33-36]。通過對3個品種的萌發指標及生理生化指標進行隸屬函數分析，最終確定了3個品種抗旱能力為黃豆>鄭9007>晉豆19，黃豆的綜合隸屬函數值為0.997，而晉豆19和鄭9007分別為0.176和0.219，可見大豆野生種黃豆的抗旱能力遠遠高于其它2個品種，可以利用這一種質資源進行大豆抗旱遺傳改良，培育抗旱節水的大豆新品種。

參考文獻：

[1] 呂 妍,王讓會,蔡子穎.我國干旱半干旱地區氣候變化及其影響[J].干旱區資源與環境,2009,23(11):65-71.

[2] 吳 偉,陳學珍,謝 皓,等.干旱脅迫下大豆抗旱性鑒定[J].分子植物育種,2005,3(2):188-194.

[3] 李貴全,張海燕,季 蘭,等.不同大豆品種抗旱性綜合評價[J].應用生態學報,2006,17(12):2408-2412.

[4] 王 敏,楊萬明,侯燕平,等.不同類型大豆花莢期抗旱性形態指標及其綜合評價[J].核農學報,2010，24(1):154-159.

[5] 肖佳雷,李 煒,來永才,等.黑龍江省春大豆種質資源芽期抗旱鑒定與篩選[J].作物雜志,2012(1):142-145.

[6] 王興榮,張彥軍,茍作旺,等.大豆種質資源抗旱性綜合評價[J].干旱地區農業研究,2015,33(5):17-23.

[7] 祁旭升,劉章雄,關榮霞,等.大豆成株期抗旱性鑒定評價方法研究[J].作物學報,2012,38(4):665-674.

[8] 鞠 樂,齊軍倉,成祿艷,等.大麥種子萌發期對干旱脅迫的生理響應及其抗旱性評價[J].西南農業學報,2013,26(1):93-98.

[9] 景蕊蓮,昌小平.用滲透脅迫鑒定小麥種子萌發期抗旱性的方法分析[J].植物遺傳資源學報,2003,4(4):292-296.

[10] 周國雁,隆文杰,雷涌濤,等.PEG處理下小麥種子萌發期的性狀變化與品種抗旱性級別劃分[J].西南農業學報,2015,28(6):2348-2354.

[11] 董志強,賈秀領,張麗華,等.玉米種子萌發期抗旱性鑒定方法及不同雜交種抗旱性比較研究[J].華北農學報,2012,27(1):178-183.

[12] 余貴海,起雪宏,王正啟,等.14個玉米雜交種萌發期抗旱性評價[J].西南農業學報,2016,29(7):1499-1505.

[13] 敬禮恒,陳光輝,劉利成,等.水稻種子萌發期的抗旱性鑒定指標研究[J].雜交水稻,2014,29(3):65-69.

[14] 田又升,謝宗銘,吳向東,等.水稻種質資源萌發期抗旱性綜合鑒定[J].干旱地區農業研究,2015,33(4):173-180.

[15] 王燕平,王曉梅,侯國強,等.室內模擬干旱對大豆萌發性狀的影響及抗旱性評價[J].核農學報,2014,28(6):1133-1141.

[16] 周玉麗,朱 平,胡能兵,等.不同大豆品種發芽期耐旱性評價及耐旱種質篩選[J].大豆科學,2015,34(4):616-623.

[17] 王利彬,劉麗君,裴宇峰,等.大豆種質資源芽期抗旱性鑒定[J].東北農業大學學報,2012,43(1):36-43.

[18] 舒英杰,周玉麗,時俠清,等.大豆種子發芽期耐旱性鑒定的適宜PEG-6000濃度篩選[J].大豆科學,2015,34(1):56-59.

[19] 張志良,瞿偉菁.植物生理學實驗指導(第3版)[M].北京:高等教育出版社,2003.

[20] 鄒 琦.植物生理學實驗指導[M].北京:中國農業出版社,2000.

[21] Troll W, Lindsley J. A photometric method for the determination of proline[J]. Journal of Biological Chemistry, 1955,215(2):655-660.

[22] 李合生.植物生理生化實驗原理和技術[M].北京:高等教育出版社,2000.

[23] 裴帥帥,尹美強,溫銀元,等.不同品種谷子種子萌發期對干旱脅迫的生理響應及其抗旱性評價[J].核農學報,2014,28(10):1897-1904.

[24] Asada K. Production and scavenging of reactive oxygen species in chloroplasts and their functions[J]. Plant Physiology, 2006,141:2391-2396.

[25] Rizhsky L, Liang H, Shuman J, et al. When defense pathways collide. The response of Arabidopsis to a combination of drought and heat stress[J]. Plant Physiology, 2004,134(4):1683-1696.

[26] Mahajan S, Tuteja N. Cold, salinity and drought stresses: an overview[J]. Archives of biochemistry and biophysics, 2005,444(2):139-158.

[27] 杜潤峰,郝文芳,王龍飛.達烏里胡枝子抗氧化保護系統及膜脂過氧化對干旱脅迫及復水的動態響應[J].草業學報,2012,21(2):51-61.

[28] 聶石輝,齊軍倉,張海祿,等.PEG6000模擬干旱脅迫對大麥幼苗丙二醛含量及保護酶活性的影響[J].新疆農業科學,2011,48(1):11-17.

[29] 王 娟,李德全.逆境條件下植物體內滲透調節物質的積累與活性氧代謝[J].植物學報,2001,18(4):459-465.

[30] 周 嬋,楊允菲,李建東.松嫩平原兩種趨異類型羊草對干旱脅迫的生理響應[J].應用生態學報,2002,13(9):1109-1112.

[31] 許 興,鄭國琦,鄧西平,等.水分和鹽分脅迫下春小麥幼苗滲透調節物質積累的比較研究[J].干旱地區農業研究,2002,20(1):52-56.

[32] 李樹華,許 興,米海莉,等.水分脅迫對牛心樸子植株生長及滲透調節物質積累的影響[J].西北植物學報,2003,23(4):592-596.

[33] 陳榮敏,楊學舉,梁鳳山,等.利用隸屬函數法綜合評價冬小麥的抗旱性[J].河北農業大學學報,2002，25(2):7-9.

[34] 嚴明建,黃文章,胡景濤,等.應用隸屬函數法鑒定水稻的抗旱性[J].雜交水稻,2009,24(5):76-79.

[35] 楊進文,朱俊剛,王曙光,等.用GGE雙標圖及隸屬函數綜合分析山西小麥地方品種抗旱性[J].應用生態學報,2013,24(4):1031-1038.

[36] 祁旭升,王興榮,許 軍,等.胡麻種質資源成株期抗旱性評價[J].中國農業科學,2010,43(15):3076-3087.