二苯甲酮對蛋白核小球藻的毒性研究

王海洋 許曉路 張德勇

（浙江樹人大學生物與環境工程學院 浙江杭州 310015）

引言

二苯甲酮（Benzophenone，BP）具有抑制苯乙烯聚合、香料定香和紫外吸收等多種功能，長期以來作為紫外線吸收劑、有機顏料、醫藥、香料、薄膜涂層的光敏劑、殺蟲劑的中間體被廣泛應用于各個領域，并大量被排放到水體、土壤等環境介質中，甚至在各類生物體中也已檢測到[1]。防曬霜、護膚液等個人護理品及食品包裝袋等產品中的BP還可通過飲食、呼吸和皮膚接觸等途徑進入人體[2,3]。體外實驗表明BP對內分泌系統有明顯的干擾效應，并具有發育毒性等[4]。目前，關于水體中的BP對藻類的影響研究尚少，有許多問題亟待闡明。通過分析BP對蛋白核小球藻的毒性，可為BP污染生態風險評價提供依據，并為全面認識其對生態環境和人類健康的影響提供參考。同時，也可為研究此類污染物對其他生物的致毒機理提供參考，并為此類化學物質的使用管理提供依據。

1 材料與方法

1.1 藻類染毒

配制含系列濃度BP的HB-4培養液，于三角瓶中培養蛋白核小球藻，初始濃度為7×105個/mL[5]。染毒實驗中的BP染毒劑量如表1及表2所示。藻類培養方法為四層紗布封口，在25℃、12h/12h光照黑暗循環下培養八天，每組設三重復組。每天進行取樣并分析藻類增殖速度，染毒實驗完成后測葉綠素含量、各抗氧化酶活力、MDA含量等，利用SPSS軟件的One-way ANOVA法分析不同組結果之間的差異顯著性。

1.2 96h-EC50計算

蛋白核小球藻生物量用前期建立的光密度法進行計算，公式為y=0.0164x-0.0299。公式中y指A690值，x指藻類數量（×106個/mL）。根據計算出的96h后各組的細胞數量，計算BP對藻類生長的抑制率，并根據Jiang等的報道計算出96h-EC50值[6]。

1.3 葉綠素含量分析

將30mL藻液首先用微孔濾膜進行過濾，收集藻細胞，轉移進研缽并加少許乙醇或研磨。然后離心，收集濾液并定容到10 mL，在4℃、避光環境中放置4h。上述提取液于3000g速度離心20min，將上清轉移到比色管后用90%乙醇定容到10mL。將上清進行光度計分析，測量A665和A649值。計算公式為：葉綠素a（mg/L）=13.95A665-6.88A649；葉綠素 b（mg/L）=24.96A649-7.32A665。兩者相加則得到總葉綠素的濃度。

1.4 抗氧化酶活力分析

將30mL藻液在4000g速度下離心15min，取沉淀并以PBS（pH7.8）重新懸浮，并用超聲波法進行破碎。以5000g速度離心10min后收集上清，即為粗酶液。然后可分別測定超氧化歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）及過氧化物酶（POD）活性。CAT、SOD活力根據Chen等的報道測定[7]。POD活力根據Bewley等的報道測定[8]。

1.5 丙二醛（MDA）含量分析

將30mL藻液用微孔濾膜過濾，收集藻體，然后加入10%TCA后研磨使藻細胞破碎，然后在5000g速度下離心10min，收集上清液，即為MDA液。然后移取2 ml該MDA提取液到試管，再加入2 mL的 0.6%硫代巴比妥酸，于沸水浴條件下處理10min，然后快速冷卻。再進行4000g速度離心10min，上清液馬上測吸光度值。計算公式為：MDA濃度=6.45（A532-A600）-0.56*A450[9]。

2 結果

2.1 96h-EC50值

經計算，BP對蛋白核小球藻的抑制率(P%)和濃度的自然對數(LnC)的線性回歸方程：y=0.1117x+0.3455，R2=0.9947，其 96h-EC50值為3.98 mg/L。

2.2 葉綠素及MDA含量

如表1所示，當BP劑量╭2.6mg/L時，引起蛋白核小球藻中葉綠素a含量降低（p＜0.05）；當BP濃度╭3.9mg/L時，導致蛋白核小球藻中葉綠素b含量、總葉綠素含量均降低（p＜0.05）；當BP濃度╭2.6mg/L時，導致蛋白核小球藻中MDA含量上升（p＜0.05）。上述結果證實BP可影響蛋白核小球藻中的葉綠素含量與MDA含量。

表1 各組葉綠素含量及MDA含量

2.3 抗氧化酶的活性

如表2所示，當BP濃度╭6.5mg/L時，導致蛋白核小球藻中SOD活力下降（p＜0.05）；當BP濃度╭6.5 mg/L時，導致蛋白核小球藻中的CAT、POD活性均降低（p＜0.05）。

表2 各組抗氧化酶類活性

結語

本研究初步證實了BP對蛋白核小球藻的毒性效應，會降低藻類增殖速度。經過8天染毒后，BP暴露可導致蛋白核小球藻中的葉綠素含量降低、MDA含量升高及抗氧化酶類活性下降。上述效應主要在BP濃度達到3.9mg/L時開始出現。當BP染毒濃度達到7.8mg/L后，葉綠素a含量下降了約76%，葉綠素b含量下降了約54%，MDA濃度上升了73%左右，CAT活力下降了57%左右，POD活力下降了46%左右，SOD活力降低了71%左右，顯示該濃度下的BP對藻類的生理代謝有顯著干擾。

作為進行光合作用的場所和基本條件，葉綠素含量直接反映藻類代謝和增殖活力的情況。本研究中，當BP濃度達3.9mg/L時，無論葉綠素a還是葉綠素b均開始表現出數量的下降（p＜0.05），顯示BP對藻類的毒性與光合作用有關，且效應與劑量大致呈正相關。本研究中測定的抗氧化酶類，其功能主要是通過清除細胞內的活性氧來幫助藻細胞維持平衡的氧代謝，以避免細胞膜的膜脂發生過氧化損傷。在本研究中，BP濃度達3.9mg/L時，對抗氧化酶活性的抑制作用普遍出現，且與劑量大致呈正相關。本研究中分析的MDA含量則是細胞膜質發生過氧化后產生的分子，是一種抗逆性分子，其含量可反映藻類的逆境傷害情況。MDA在藻類處于脅迫環境中時會增加含量以應對脅迫。本研究中當BP劑量達到3.9mg/L時，MDA濃度增高（p＜0.05），證實藻類發生了膜脂過氧化及細胞的損傷?？傮w看來，BP對淡水藻類有多方面的毒性效應，如果任由其大量排放，可能會對生態環境造成破壞，值得關注。

參考文獻

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[4]Schlumpf M,et al.Endocrine activity and developmental toxicity of cosmetic UV filters-An update[J].Toxicology,2004,205 (1-2):113-22.

[5]沈韞芬等.微型生物監測新技術,北京:中國建筑工業出版社,1990,275-86.

[6]蔣亞林等.細胞生物學實驗 [M],上海:復旦大學出版社,1996,16-17.

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[8]Bewley TD.1979.Physiological aspects of desiccation tolerance.Ann Rev Plant Physiol,1979,30:195-238.

[9]Srivastava OP,et al.Evidence for close association of POD polyphenol oxidase and IAA oxidase isoenzyme of peanut suspension culture medium.Can J Bot,1973,51:2207-15.