健脾益智法對AD大鼠海馬區(qū)、大腸區(qū)腦腸肽SP表達(dá)水平影響的研究?

邱佳慧，紀(jì)立金

(福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福州 350122)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種以持續(xù)性認(rèn)知功能衰退為表現(xiàn)的進(jìn)行性腦退化疾病。近年來，各項研究均佐證了脾腦相關(guān)理論，如強脾補精化瘀益智法組成的強脾補精化瘀益智膠囊具有提高學(xué)習(xí)記憶能力的作用[1]，可保護膽堿能神經(jīng)元，同時利于受損神經(jīng)元的再生修復(fù)，進(jìn)而治療AD[2]。錢會南[3]等研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用調(diào)理脾胃之方對癲癇、癡呆、抑郁癥等神志病都有良好的防治效果。P物質(zhì)(substance P，SP)廣泛分布于中樞及消化系統(tǒng)中，是發(fā)揮相應(yīng)生理作用的腦腸肽。認(rèn)為SP是脾(腸、胃)腦共同的物質(zhì)基礎(chǔ)，推測SP與腦、脾胃之間存在雙向調(diào)控，是脾腦相互作用的媒介。健脾益智法是以健脾為主，少佐補精化瘀祛濁，達(dá)生志益智除呆之目的的治療方法。本實驗以AD大鼠為載體，以其空間學(xué)習(xí)記憶能力及海馬區(qū)、大腸區(qū)腦腸肽SP表達(dá)水平為研究對象，探討健脾益智法對其空間學(xué)習(xí)記憶能力改善情況，對AD大鼠海馬區(qū)、大腸區(qū)腦腸肽SP表達(dá)水平的影響及其關(guān)聯(lián)，挖掘脾腦相關(guān)理論的微觀機制，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

清潔級7周齡SD大鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量(250±10) g，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供(動物許可證號SCXK(滬)2012-0002)。

1.2 藥物

以健脾益智法為組方原則，按人參10 g、黃芪20 g、白術(shù)20 g、制何首烏15 g、菖蒲6 g、遠(yuǎn)志6 g、水蛭3 g比例組成，制備成健脾益智混懸液(0.5 g/ml)。

1.3 試劑及儀器

試劑：Aβ1-40(Sigma、A1075)，PBS (1×)、10%水合氯醛、碘伏、75%酒精、0.9%氯化鈉注射液、無水乙醇、即用型SABC-POD(小鼠/兔IgG)試劑盒(博士德，SA1020)、DAB顯色試劑盒(黃)(博士德，AR1022)、黏附載玻片、顯微鏡蓋玻片、Anti-Substance P antibody(ab14184)、多聚甲醛。儀器：腦立體定位儀、微量注射針、Morris水迷宮、-80℃超低溫冰箱、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、生物組織烤片機、石蠟切片機、Olympus顯微鏡。

2 方法

2.1 制作AD大鼠模型

參考唐軍等方法[4]制作AD大鼠模型，其中Aβ1-40溶液注射區(qū)域為右側(cè)海馬齒狀回背側(cè)細(xì)胞，注射坐標(biāo)參考包新民腦立體定位圖譜。造模后4周，借助行為學(xué)檢測判斷AD造模是否成功。

2.2 分組灌胃給藥

采用隨機數(shù)字表法將40只清潔級SD大鼠分成4組，造模4周后剔除造模失敗和術(shù)后死亡的大鼠，假手術(shù)組6只，模型對照組7只，中藥組10只，西藥組8只，開始為期4周每日1次的灌胃。中藥組給予健脾益智混懸液(14.4 ml/kg/d)，西藥組給予吡拉西坦混懸液(14.4 ml/kg/d)，其他組給予等量0.9%氯化鈉溶液(14.4 ml/kg/d)。大鼠給藥劑量按《中藥藥理研究方法學(xué)》所提供的“實驗動物與人按體表面積等效劑量換算比率表”倍數(shù)折算。

2.3 Morris水迷宮實驗

通過Morris水迷宮的定位航行實驗和空間探索實驗，反映學(xué)習(xí)和記憶的基本情況。

Morris水迷宮實驗歷時5 d，前4 d是定位航行實驗，即每天于固定時段將大鼠面對池壁，分別從4個不同入水點放入水中，進(jìn)行尋找水下平臺訓(xùn)練，由錄像系統(tǒng)記錄大鼠找到平臺的時間，即逃避潛伏期。第5天是空間探索實驗，即撤除原水下平臺，隨機擇一入水點將大鼠面對池壁放入水中，由錄像系統(tǒng)記錄大鼠在最大潛伏期內(nèi)的跨越平臺次數(shù)。

2.4 免疫組化方法檢測大鼠海馬區(qū)、大腸區(qū)腦腸肽SP表達(dá)水平

Morris水迷宮實驗結(jié)束后，麻醉大鼠，4%多聚甲醛灌注固定，冰上取腦、大腸石蠟包埋、切片，采用免疫組化法測定大鼠海馬區(qū)、大腸區(qū)腦腸肽SP的表達(dá)水平。光學(xué)倒置顯微鏡高倍(10×20倍)下隨機選取3個視野，通過圖像分析軟件Fiji進(jìn)行平均光密度檢測，取平均值作為檢測值。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 Morris水迷宮實驗結(jié)果

表1顯示，定位航行實驗中與模型對照組、西藥組比較，中藥組逃避潛伏期明顯降低(P<0.05)，與假手術(shù)組比較，模型對照組逃避潛伏期明顯升高(P<0.05)，其余組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。空間探索實驗中，與模型對照組比較，中藥組、西藥組跨越平臺次數(shù)明顯升高(P<0.05)，與假手術(shù)組比較，模型對照組跨越平臺次數(shù)明顯降低(P<0.05)，其余組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。說明健脾益智混懸液可明顯縮短逃避潛伏期，明顯增加跨越平臺次數(shù)，西藥吡拉西坦僅能明顯增加跨越平臺次數(shù)。

表1 各組大鼠逃避潛伏期(s)和跨越平臺次數(shù)(次)比較

注：與假手術(shù)組比較：aP<0.05；與模型對照組比較：bP<0.05；與西藥組比較：cP<0.05

3.2 各組大鼠海馬區(qū)、大腸區(qū)腦腸肽SP免疫組化實驗結(jié)果

表2圖1顯示，與假手術(shù)組、模型對照組、西藥組比較，中藥組海馬區(qū)腦腸肽SP表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。與模型對照組比較，西藥組海馬區(qū)腦腸肽SP表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。表2圖2顯示，與模型對照組、西藥組比較，中藥組大腸區(qū)腦腸肽SP表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。與模型對照組比較，西藥組大腸區(qū)腦腸肽SP表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。由此說明，健脾益智混懸液可上調(diào)AD大鼠海馬區(qū)、大腸區(qū)腦腸肽SP表達(dá)水平，西藥吡拉西坦不能上調(diào)AD大鼠海馬區(qū)、大腸區(qū)腦腸肽SP表達(dá)水平。

表2 各組大鼠海馬區(qū)、大腸區(qū)腦腸肽SP表達(dá)水平比較

注：與假手術(shù)組比較：aP<0.05，bP<0.01；與模型對照組比較：cP<0.01；與西藥組比較：dP<0.01

圖1 各組大鼠海馬區(qū)腦腸肽SP的表達(dá)(DAB顯色)注：圖1中箭頭所示之處為典型陽性表達(dá)區(qū)域，屬海馬組織的CA1區(qū)

圖2 各組大鼠大腸區(qū)腦腸肽SP的表達(dá)(DAB顯色)注：圖2中箭頭所示之處為典型陽性表達(dá)區(qū)域，屬升結(jié)腸組織的黏膜層

4 討論

健脾益智法通過健脾胃，利用機體脾腦關(guān)系，間接益智為主，輔以益智中藥直接益智，間接與直接雙管齊下，以達(dá)療效。AD的病理是以脾虛為核心，兼以精虧、濁瘀，治療當(dāng)以補脾益智為主，與健脾益智法旨意相合，認(rèn)為健脾益智法是治療AD的有效治法。本研究創(chuàng)建健脾益智混懸液，方中人參10 g、黃芪20 g、白術(shù)20 g為君，甘溫入脾，大補脾氣，輔以何首烏15 g補益腎精，石菖蒲6 g化濁開竅，遠(yuǎn)志6 g安神兼以化濁，水蛭3 g活血化瘀。

SP廣泛分布于中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)，能調(diào)節(jié)神經(jīng)元活動，發(fā)揮著神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)的作用[5]。另外，SP是良好的血管舒張劑，增加血流量，增強腦代謝，并可抑制AD病理學(xué)標(biāo)志β-淀粉樣蛋白的效應(yīng)[5]81，進(jìn)而改善AD腦部病變。由此認(rèn)為，SP能延緩AD病理標(biāo)志老年斑的病理進(jìn)展。消化系統(tǒng)中，SP對胃腸道大部分平滑肌具有很強的刺激效應(yīng)，引起收縮并促進(jìn)胃腸蠕動。SP可激活胃腸道膽堿能神經(jīng)元，并增加乙酰膽堿效應(yīng)。SP對胃腸道有上皮保護和促進(jìn)黏膜愈合的重要作用，可促進(jìn)大小腸水和電解質(zhì)的分泌，抑制小腸的吸收[5]79。上述SP生理作用，提示SP是消化系統(tǒng)功能、形態(tài)的物質(zhì)保障。由此可知，SP可作為脾(腸、胃)功能狀態(tài)和AD進(jìn)展的評價指標(biāo)，是脾腦共同的物質(zhì)基礎(chǔ)，推測其是脾腦相互作用的媒介。

本研究采用Morris水迷宮實驗，結(jié)果顯示健脾益智混懸液可明顯縮短逃避潛伏期及明顯增加跨越平臺次數(shù)。從宏觀層面佐證了健脾益智法可提升AD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，肯定了健脾益智法治療AD的療效，為臨床治療AD提供了新思路。微觀層面，本研究采用免疫組化方法，研究健脾益智法對AD大鼠海馬區(qū)、大腸區(qū)腦腸肽SP表達(dá)水平的影響及其關(guān)聯(lián)。結(jié)果顯示，健脾益智混懸液可同步上調(diào)AD大鼠海馬區(qū)、大腸區(qū)腦腸肽SP表達(dá)水平。認(rèn)為健脾益智法可同步上調(diào)海馬區(qū)、大腸區(qū)腦腸肽SP表達(dá)水平。綜上所述，可知健脾益智法同步提升AD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力和AD大鼠海馬區(qū)、大腸區(qū)腦腸肽SP表達(dá)水平。因為腦腸肽SP在中樞及消化系統(tǒng)的雙重分布，并發(fā)揮相應(yīng)生理作用，所以認(rèn)為AD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的提升與AD大鼠海馬區(qū)、大腸區(qū)腦腸肽SP表達(dá)水平的提升有關(guān)，推測腦腸肽SP是健脾益智法治療AD的微觀作用靶點，即健脾益智法通過同步提高腦腸中腦腸肽SP的表達(dá)水平，同步改善脾腦狀態(tài)，其中借助海馬區(qū)腦腸肽SP表達(dá)水平的提高及其中樞的生理作用，如調(diào)節(jié)神經(jīng)元、充當(dāng)遞質(zhì)和調(diào)質(zhì)、增強腦代謝、抑制β樣蛋白效應(yīng)，使治療AD起效，為健脾益智法治療AD提供實驗依據(jù)。但由于實驗動物樣本量有限，致實驗仍存在局限性，以及脾腦相關(guān)理論的微觀機制尚未完全闡明，本課題組將繼續(xù)進(jìn)行相關(guān)研究。

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