hMAM mRNA表達(dá)情況與乳腺癌的關(guān)系

冀峰，呂復(fù)君，李延翠

開封市中心醫(yī)院1乳腺甲狀腺科，2神經(jīng)外科，河南開封4750000

乳腺癌多發(fā)于女性，是威脅人類健康的惡性腫瘤之一[1]，根據(jù)病情的嚴(yán)重程度不同，臨床上可選取不同的治療方法，如手術(shù)、放療、化療、靶向治療等。為提高乳腺癌的治療效果，大多數(shù)患者采用乳腺癌局部與全身聯(lián)合治療[2]。目前，臨床上通過監(jiān)測腋窩淋巴結(jié)狀況、原發(fā)癌灶大小、激素受體狀況、原癌基因及抑癌基因的變化，從而預(yù)測乳腺癌病情的嚴(yán)重程度。然而乳腺癌術(shù)后可能會出現(xiàn)復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，上述指標(biāo)對于微轉(zhuǎn)移癌的靈敏度較低，因此，選擇靈敏度高的檢測指標(biāo)對乳腺癌的病情評估及治療尤其重要[3]。已有研究表明，人乳腺珠蛋白（human mammaglobin，hMAM）mRNA在正常細(xì)胞中表達(dá)較低，在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)升高[4]，但有關(guān)hMAMmRNA表達(dá)與乳腺癌發(fā)病關(guān)系的研究較少。本研究采用巢式-逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（Nested-RT-PCR）檢測乳腺癌患者的外周血hMAMmRNA表達(dá)情況，旨在探討hMAMmRNA表達(dá)與乳腺癌患者臨床特征的關(guān)系，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2016年1月至2017年3月于開封市中心醫(yī)院治療的乳腺癌患者87例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)病理學(xué)診斷確診；②入組前未行放療或化療等治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他原發(fā)性腫瘤的患者。同時選取70例乳腺良性腫瘤患者和50例健康志愿者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①乳腺良性腫瘤患者均經(jīng)病理學(xué)診斷確診；②健康志愿者身體健康。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有乳腺癌家族史者；②有乳腺治療史者。乳腺癌患者中，男4例，女83例；年齡（50.43±6.84）歲；乳腺良性腫瘤患者中，男2例，女68例，年齡（49.81±8.03）歲；健康志愿者中，男1例，女49例；年齡（51.03±7.10）歲。3組研究對象的性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。所有研究對象均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 實驗方法

1.2.1hMAMmRNA及內(nèi)參照引物hMAMmRNA上游外引物序列為5′-GAAGTTGCTGATGGTCCTCATGCTGGC-3′，下游外引物序列為 5′-CTCACCATACCCTGCAGTTCTGTGAGC-3′，擴(kuò)增目的片斷長度為324 bp；hMAMmRNA上游內(nèi)引物序列為5′-CTCCCAGCACTGCTACGCAGGCTC-3′，下游內(nèi)引物序列為5′-CACCTCAACATTGCTCAGAGTTTCATCCG-3′，擴(kuò)增目的片段長度為201 bp。PBGD參照物上游引物序列為5′-GACTGGAGGAGTCTGGAGTC-3′，下 游 引 物 序 列 為 5′-AATCCCTGGAAGGCTTGAAC-3′，擴(kuò)增目的片斷長度為186 bp，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成[5]。

1.2.2 標(biāo)本采集抽取研究對象的肘靜脈血5 ml，加入1/8體積的檸檬酸鈉（武漢博士德生物有限公司）進(jìn)行抗凝，采用淋巴細(xì)胞分離液（上海研謹(jǐn)生物有限公司）分離單個核細(xì)胞，在德國徠卡DMI4000倒置顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞數(shù)為5×106個。采用Trizol試劑盒（百泰克生物有限公司）抽提細(xì)胞總RNA，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。采用德國耶拿SPE-KOL1300紫外分光光度計測量260 nm和280 nm處的吸光度值（A值），A260/A280在1.8～2.0為質(zhì)量合格的RNA，可用于后續(xù)實驗[6]。

1.2.3 Nested-RT-PCR 抽提細(xì)胞總RNA，第1步進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR），采用Promega公司提供的試劑盒，反應(yīng)體系如下：0.1 U/μl的鳥類成髓細(xì)胞性白細(xì)胞病毒（AMV）反應(yīng)緩沖液10 μl，0.5 mmol/L的上游外及下游外引物各1 μl，0.2 mmol/L的dNTP1 μl，0.1 U/μl的DNA聚合酶1 μl，2 μg RNA，加去離子水至總反應(yīng)體積 50 μl。PCR反應(yīng)條件：94 ℃、3 min（預(yù)變性），94 ℃、30 s（變性），58 ℃、1 min（退火），68 ℃、1.5 min（擴(kuò)增），共35個循環(huán)；70℃、7 min（延伸）。第2步反應(yīng)體系如下：AMV反應(yīng)緩沖液10 μl，0.5 mmol/L的上游內(nèi)及下游內(nèi)引物各 1 μl，0.2 mmol/L 的 dNTP 1 μl，0.1 U/μl的DNA聚合酶1 μl，取第1次反應(yīng)產(chǎn)物2 μl，加去離子水至總體積50 μl。PCR反應(yīng)條件：94 ℃、3 min（預(yù)變性），94 ℃、30 s（變性），59 ℃、1 min（退火），68 ℃、1 min（擴(kuò)增），共35個循環(huán)；70 ℃、7 min（延伸）[7]。1.2.4結(jié)果觀察對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用2%瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色顯示DNA條帶，紫外線下顯像，201 bp處出現(xiàn)DNA條帶時為陽性結(jié)果。

1.3 治療方法

乳腺癌良性腫瘤患者均經(jīng)MMT（Mammotome）微創(chuàng)手術(shù)治療；Ⅰ、Ⅱ期乳腺癌患者行保乳/改良根治術(shù)治療，Ⅲ期乳腺癌患者行多西他賽+表柔比星+環(huán)磷酰胺（TEC）方案輔助化療；Ⅳ期乳腺癌患者行長春瑞濱+順鉑（NP）或長春瑞濱+卡培他濱（NX）方案姑息化療。分別于化療前及化療3個周期后采用Nested-RT-PCR法檢測乳腺癌患者的外周血hMAMmRNA表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件對-數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血hMAM mRNA陽性率的比較

乳腺癌患者化療前的外周血hMAMmRNA陽性率為54.02%（47/87），高于乳腺良性腫瘤患者的1.43%（1/70）和健康志愿者的0，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；乳腺良性腫瘤患者和健康志愿者的外周血hMAMmRNA陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 外周血hMAM mRNA陽性率與乳腺癌患者臨床特征的關(guān)系

乳腺癌患者的外周血hMAMmRNA陽性率與患者年齡、性別、腫瘤直徑、病理類型、雌激素受體和孕激素受體表達(dá)情況無關(guān)（P＞0.05），與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者的hMAMmRNA陽性率高于Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.05）。（表1）

2.3 乳腺癌患者化療前后外周血hMAM mRNA陽性率的比較

乳腺癌患者化療后的外周血hMAMmRNA陽性率為18.39%（16/87），低于化療前的54.02%（47/87），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=23.912，P＜0.05）；且化療前外周血hMAMmRNA表達(dá)陰性者，化療后無陽轉(zhuǎn)。

3 討論

乳腺癌原發(fā)于乳腺腺上皮組織，癌細(xì)胞之間連接松散，易脫落，具有早期轉(zhuǎn)移的特點，游離的癌細(xì)胞可隨血液轉(zhuǎn)移至全身，因此檢測癌細(xì)胞是否發(fā)生轉(zhuǎn)移對乳腺癌臨床治療方案的選擇及預(yù)后判斷具有重要作用[8]。目前，乳腺癌常見的轉(zhuǎn)移部位有腋窩淋巴結(jié)、骨髓、外周血，但常規(guī)檢測方法并不能檢測出微小轉(zhuǎn)移病灶。因此，選擇一種靈敏度及特異度較高的檢測指標(biāo)對提高乳腺癌患者的臨床治療效果具有重要意義[9]。

表1 外周血hMAM mRNA陽性率與乳腺癌患者臨床特征的關(guān)系

研究表明，hMAM是第1個應(yīng)用差異篩選分離到的乳腺組織相關(guān)基因，位于11號染色體上，hMAM只表達(dá)于成人乳腺組織中，當(dāng)乳腺組織發(fā)生癌變時，表達(dá)增多[10]。目前，有關(guān)hMAMmRNA表達(dá)與乳腺癌發(fā)病關(guān)系的研究較少。本研究采用Nested-RT-PCR檢測乳腺癌患者的外周血hMAMmRNA表達(dá)情況，旨在探討hMAMmRNA表達(dá)與乳腺癌患者臨床特征的關(guān)系。RT-PCR是hMAM特異性檢測方法之一，能夠在多個細(xì)胞中篩選出一個癌細(xì)胞[11]。RT-PCR的原理：從可表達(dá)hMAM的組織或細(xì)胞中提取總RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，在引物的作用下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將獲得的cDNA片段進(jìn)行凝膠電泳分離[12-14]。Nested-RT-PCR是將RT-PCR產(chǎn)物作為模板，進(jìn)行擴(kuò)增，可增強(qiáng)反應(yīng)的特異性，提高檢測的準(zhǔn)確性[15]。本研究結(jié)果表明，乳腺癌患者化療前的外周血hMAMmRNA陽性率為54.02%（47/87），高于乳腺良性腫瘤患者的1.43%（1/70）和健康志愿者的0，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；乳腺良性腫瘤患者和健康志愿者的外周血hMAMmRNA陽性率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。說明hMAMmRNA在乳腺良性腫瘤患者及健康志愿者的外周血中低表達(dá)或不表達(dá)，而在乳腺癌患者中表達(dá)升高。本研究還發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者的外周血hMAMmRNA陽性率與患者年齡、性別、腫瘤直徑、病理類型、雌激素受體和孕激素受體表達(dá)情況無關(guān)（P＞0.05），與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者的hMAMmRNA陽性率高于Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（P＜0.05）。說明乳腺癌的發(fā)病可能不受機(jī)體其他生理因素的影響，治療時應(yīng)控制淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，從而避免病情加重或術(shù)后復(fù)發(fā)。綜上所述，乳腺癌患者外周血hMAMmRNA的陽性表達(dá)與TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，可為臨床診斷和預(yù)后判斷提供依據(jù)。

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