楊桃果汁對肝組織抗氧化應(yīng)激及降糖的研究

楊映霞，黃天敏，黃仁彬，徐小惠

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，廣西南寧530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧530021）

糖尿病是一種慢性糖脂代謝紊亂的疾病，而肝臟作為糖脂代謝的重要器官，兩者關(guān)系密不可切。這與肝臟內(nèi)過量的氧化應(yīng)激導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能障礙和胰島素分泌受損有關(guān)[1-3]。近年來，2型糖尿病發(fā)病率仍在世界各地大幅增加[4]，其損害肝臟組織的問題也越來越得到重視[5]。

楊桃產(chǎn)自熱帶、亞熱帶，是被子植物門五斂子屬的一種，可治療消化系統(tǒng)疾病、咳嗽和糖尿病等[6-7]，營養(yǎng)價(jià)值高且味道酸甜爽口，易被人群接受。多項(xiàng)研究表明楊桃提取物具有降血糖、改善胰島細(xì)胞凋亡、改善糖尿病腎病的治療作用以及體外抗氧化的治療作用[8-11]。本研究進(jìn)一步探討楊桃果汁對糖尿病小鼠肝組織抗氧化應(yīng)激及其降糖作用的影響，以期完善楊桃藥理功效，為臨床提供合理用藥。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

SPF 級雄性昆明小鼠，體重（20±2）g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。動物飼養(yǎng)于符合醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物環(huán)境設(shè)施要求的飼養(yǎng)環(huán)境中。飼養(yǎng)環(huán)境通風(fēng)良好，室溫18℃～25℃，相對濕度40%～70%，12 h光照晝夜循環(huán)。實(shí)驗(yàn)動物使用許可證SCXK（桂）2009－0002。

楊桃于2013年6月采自于中國廣西靈山縣，經(jīng)過廣西中醫(yī)藥研究院賴茂祥教授鑒定，制成含生藥濃度為5 kg/L的試液，儲存于陰涼干燥環(huán)境中備用。

鹽酸二甲雙胍片（批號：131019）：北京京豐制藥有限公司；鏈脲佐菌素（有效期：201512）：美國sigma公司；考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒（批號：20140113）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號：20140210）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試盒（批號：20140114）、糖原測定試劑盒（批號：20140209）：南京建成生物工程研究所；小鼠琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（批號：201411）、小鼠環(huán)磷酸腺苷酶（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）聯(lián)免疫分析試劑盒（批號：201411）：北京誠林生物科技有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

722型分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限責(zé)任公司；RE-52旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器、CENTRIFUGE TDL-5型離心機(jī)：上海安亭實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；FORMA 991超低溫冰箱：Thermo Fornma公司；LDZ4-0.4自動平衡微型離心機(jī)：北京離心機(jī)廠；HANGPING JA1003型上皿電子天平：上海天平儀器廠。

1.3 糖尿病模型建立及分組給藥

取90只雄性昆明小鼠，造模前禁食12 h，隨機(jī)抽取10只作為空白組（即正常對照組），其余小鼠分別靜脈注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）0.12 g/kg。72 h后采血測定空腹血糖，凡空腹血糖≥11.1mmol/L視為糖尿病動物模型[12]。將造模成功的小鼠隨機(jī)分配成5個(gè)組，即模型對照組、二甲雙胍對照組（即陽性對照組 0.32g/kg）、楊桃果汁低、中、高劑量組（5、10、20g/kg），每組10只。每天上午空腹灌胃給藥一次，模型對照組用生理鹽水灌胃，各組連續(xù)灌胃14 d。

1.4 標(biāo)本的采集

將小鼠取血后處死，立即取其肝臟，用冰生理鹽水清洗，濾紙吸干水分，稱重后放至-80℃超低溫冰箱冷凍保存。

1.5 觀測指標(biāo)及方法

1.5.1 一般指標(biāo)及肝糖原測定

觀察小鼠的精神活動、毛發(fā)改變、飲水量、進(jìn)食量、大小便等一般狀態(tài)，并記錄體重變化情況、死亡情況等。

取肝組織標(biāo)本，稱重0.5 g，放至室溫，加入30%的氫氧化鉀溶液1.5mL，煮沸20min，放冷，加入3mL無水乙醇，煮沸，放入離心機(jī)內(nèi)以轉(zhuǎn)速3 500 r/min.離心10min，傾倒上清液，沉淀用蒸餾水溶解移入25mL容量瓶中定容，制成測試液，按蒽酮法進(jìn)行測定[13]。

1.5.2 肝組織中丙二醛（MDA）和超氧化歧化酶（SOD）測定

取肝組織標(biāo)本，稱重0.5 g，用生理鹽水配成10%肝組織液，用高速勻質(zhì)機(jī)制成10%肝組織勻漿，于冷凍離心機(jī)3 000 r/min離心15min，取上清液按試劑盒說明書用于肝組織MDA、SOD測定。

1.5.3 肝組織中琥珀酸脫氫酶 （SDH）、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）的測定

取肝組織標(biāo)本，按照試劑盒說明書對肝組織SDH、cAMP進(jìn)行操作和計(jì)算。

1.6 胰島形態(tài)學(xué)觀察

標(biāo)本常規(guī)乙醇逐級脫水，石蠟包埋，病理切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察并采集圖片。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS16.0對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P＜0.05或 P＜0.01差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊桃果汁對STZ所致糖尿病小鼠的一般狀況及肝糖原的影響

造模前小鼠精神狀態(tài)好，皮毛光滑，活動自如，飲水量、進(jìn)食量和大小便正常，造模成功后小鼠精神萎靡，出現(xiàn)多食、多飲和多尿等癥狀，成模小鼠體重略有下降。灌胃給藥后，楊桃果汁中劑量組和高劑量組的小鼠狀態(tài)有較明顯的改善，精神狀態(tài)良好，體重變化與二甲雙胍組差異不大，但相同環(huán)境下的空白組小鼠體重略有增長。各組小鼠中無死亡小鼠。

模型組小鼠的肝糖原含量明顯降低。各組糖尿病小鼠的肝糖原值與正常組比較均有所降低。楊桃果汁中、高劑量組與模型組比較肝糖原含量顯著升高（P＜0.01或 P＜0.05），低劑量組與模型組比較無顯著性差異。

結(jié)果提示楊桃果汁中、高劑量組對小鼠糖尿病癥狀改善有一定作用。各組小鼠體重、肝糖原數(shù)據(jù)見表1。

表1 楊桃果汁對STZ所致糖尿病小鼠體重及肝糖原的影響（±s）Tab le1 Theeffectof carambola fruit juiceon weightand glycogen in diabeticm ice induced by STZ（±s）

表1 楊桃果汁對STZ所致糖尿病小鼠體重及肝糖原的影響（±s）Tab le1 Theeffectof carambola fruit juiceon weightand glycogen in diabeticm ice induced by STZ（±s）

注：與模型組相比較△P＜0.05表示顯著，△△P＜0.01表示極顯著。

組別樣本/只初始體重/g 7 d體重/g 15 d體重/g肝糖原含量/（g/kg）空白 10 23.92±1.79 26.95±1.70 28.64±1.81 17.23±1.11模型 10 22.72±1.70 25.84±3.29 25.28±4.20 7.42±1.99二甲雙胍 10 22.98±1.82 26.59±2.09 26.89±3.04 12.73± 1.86△△楊桃果汁低劑量 10 23.02±0.82 25.31±1.76 25.28±2.67 8.39±1.30楊桃果汁中劑量 10 24.80±1.12 26.81±1.95 26.65±2.50 9.21±1.06△楊桃果汁高劑量 10 24.13±1.06 25.79±2.32 26.21±3.45 11.31±1.65△△

2.2 楊桃果汁對糖尿病小鼠肝組織中丙二醛（MDA）、超氧化歧化酶（SOD）、琥珀酸脫氫酶（SDH）、環(huán)磷酸腺苷（cAMP）的影響

STZ所致糖尿病各組小鼠肝組織較空白組中MDA、cAMP值有顯著增高，SOD值顯著降低，SDH含量有所降低。用藥后，楊桃果汁低、中、高劑量組小鼠較模型組小鼠均能有效降低肝組織MDA值（P＜0.01或0.05），而中、高劑量組小鼠較模型組小鼠能相應(yīng)增高SOD活力（P＜0.01）。楊桃果汁高劑量組較模型組能升高肝組織中SDH含量（P＜0.05）；能降低小鼠肝組織中cAMP含量（P＜0.05）。用藥后雖提高了機(jī)體抗氧化能力，但與正常組比較仍有顯著差異。具體數(shù)據(jù)見表2。

表2 楊桃果汁對STZ所致糖尿病小鼠肝組織MDA、SOD、SDH、cAMP的影響（±s）Table2 Theeffectsof caram bola fruit juiceon MDA，SOD，SDH and cAMP of liver tissuesof diabeticm ice induced by STZ（±s）

表2 楊桃果汁對STZ所致糖尿病小鼠肝組織MDA、SOD、SDH、cAMP的影響（±s）Table2 Theeffectsof caram bola fruit juiceon MDA，SOD，SDH and cAMP of liver tissuesof diabeticm ice induced by STZ（±s）

注：與模型組相比較△P＜0.05表示顯著，△△P＜0.01表示極顯著。

組別樣本數(shù)/只肝組織MDA/（nmol/mgprot）肝組織SOD值/（U/mgprot）SDH含量/（μmol/L）cAMP含量/（nmol/L）空白 10 7.04±0.35 403.25±16.62 210.27±34.29 2.13±0.40模型 10 18.91±1.06 198.83±16.29 158.84±25.08 2.81±0.24二甲雙胍 10 10.74±1.35△△ 350.74±19.49△△ 187.26±24.86△ 2.38±0.52△低劑量 10 17.39±1.79△ 214.85±22.30 163.31±27.34 2.77±0.34中劑量 10 16.18±1.21△△ 257.96±14.51△△ 171.80±24.61 2.65±0.31高劑量 10 12.88±1.87△△ 309.59±13.68△△ 183.17±27.65△ 2.48±0.32△

2.3 各組間小鼠胰島細(xì)胞變化比較

肉眼觀察：連續(xù)灌胃14天后取各組小鼠胰腺組織，空白組胰腺組織色淡紅，分葉狀，質(zhì)軟，無充血水腫等癥狀；模型組胰腺蒼白，分葉狀，質(zhì)中，無明顯腫大；給藥各組無明顯差異，胰腺組織色淡紅，分葉狀，質(zhì)軟，無明顯腫大。

顯微鏡下觀察：正常組胰島由大小不等的細(xì)胞團(tuán)構(gòu)成，形態(tài)規(guī)則，與胰腺組織分界線清晰可見，胰島細(xì)胞數(shù)量多，體積較大，分布飽滿均勻；模型組胰島細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，與胰腺組織分界線模糊，胰島細(xì)胞數(shù)量明顯減少，分布稀疏；二甲雙胍組較模型組胰島細(xì)胞規(guī)整，與胰腺組織分界線清楚，胰島數(shù)量相對較多；楊桃果汁高、中、低劑量組較模型組胰島細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，與胰腺組織分界線清楚，其中楊桃中劑量組較之二甲雙胍組胰島形態(tài)無明顯差別。

3 討論

各組間小鼠的體重?zé)o明顯差異，與2型糖尿病患者多以肥胖為特點(diǎn)不符[14]，可能由于小鼠患病時(shí)間短，且至今未獲得與人類糖尿病完全一致的動物模型有關(guān)[15]，又或者與投喂非高脂飼料有關(guān)。肝糖原為一種葡萄糖聚合物以糖原的形式貯存在肝臟，機(jī)體內(nèi)通過肝糖原的合成與消耗進(jìn)行血糖調(diào)節(jié)。當(dāng)血糖向肝糖原轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致血糖降低，肝糖原分解產(chǎn)生葡萄糖，血糖隨之升高[16]。本研究造模組比空白組的肝糖原明顯降低，與糖尿病患者肝糖原較正常人明顯減少的報(bào)道相符[17]。

機(jī)體內(nèi)氧化物的生成和清除出現(xiàn)失衡的一種狀態(tài)稱為氧化應(yīng)激，是2型糖尿病發(fā)生發(fā)展的危險(xiǎn)因素。作為測量氧化應(yīng)激常用指標(biāo)，MDA是脂類氧化的終產(chǎn)物，可加快糖尿病的發(fā)展[18]；SOD可清除氧自由基，減少對細(xì)胞的傷害，同時(shí)可修復(fù)氧自由基造成的細(xì)胞損傷[19]，而糖尿病可引起SOD活性降低，持久性高血糖可導(dǎo)致肝臟組織受損[20]。有報(bào)道糖尿病患者、糖尿病動物模型抗氧化能力受損，明顯低于正常情況[21-22]，與本研究結(jié)果一致。

SDH是三羧酸循環(huán)的標(biāo)志性關(guān)鍵酶，對糖的有氧氧化起著重要的調(diào)節(jié)作用[23]，通過提高其活性來降低血糖。cAMP是生命信息傳遞的“第二信使”，與胰島β細(xì)胞增殖和胰島素分泌密切相關(guān)[24]。糖尿病本身可升高cAMP，且高血糖是升cAMP必要的輔助因素[25]，這與造模組較空白組cAMP明顯提高相符。

胰島細(xì)胞形態(tài)學(xué)結(jié)果表明STZ所致糖尿病小鼠的胰島細(xì)胞存在一定損害。而楊桃果汁可以保護(hù)胰島細(xì)胞，使其形態(tài)相對完整，從而增加胰島素分泌，起到降血糖作用。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，楊桃果汁通過推動糖尿病小鼠血糖向肝糖原合成、提高SDH活性以促進(jìn)三羧酸循環(huán)、保護(hù)胰島細(xì)胞，增加血糖利用來達(dá)到降糖作用。楊桃果汁還能提高肝組織SOD活性、降低MDA含量，通過改善高血糖致氧化應(yīng)激異常對肝臟的損害，起到保護(hù)肝臟的作用。cAMP含量下降對楊桃果汁降糖有一定效果，具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

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