藜麥總皂苷含量測定方法的比較

熊成文，李曉偉，徐得娟

（1.青海省食品檢驗檢測院，青海西寧810016；2.青海高遠錦禾生態農牧科技有限公司，青海西寧810016）

研究表明許多藜麥中的皂苷類成分具有多種藥理活性[1]，包括鎮痛、抗炎、抗微生物、抗氧化、抗病毒[2]和抗細胞毒性，影響礦物質、維生素的吸收和動物生長，具有溶血和增強免疫的作用，還有增加腸黏膜滲透性，保護神經，以及降低脂肪吸收等作用[3-5]。據報道藜麥皂苷抗真菌時，單體皂苷的活性很小或基本沒有活性，而藜麥總皂苷在50μg/mL時可有效抑制白色念珠菌，說明不同皂苷之間具有協同作用[6]。藜麥皂苷具有殺螺活性[7]，還可以作為黏膜疫苗注射的助劑[8]，藜麥皂苷的構效關系的研究結果表明的五環骨架可提高藥物的選擇性[9]，因此，藜麥皂苷為治療和化療藥物的開發提供了更為豐富的資源，藜麥皂苷作為藥物也有更為廣泛的應用前景。

建立一種可靠、準確的藜麥皂苷含量測定方法，可為藜麥皂苷廣泛用于藥品、化妝品、食品添加劑等行業提供有利的評價手段，同時也可為藜麥的加工工藝水平提供參考。本文嘗試通過試驗比較兩種藜麥皂苷對照品含量方法檢測結果的差異，并對不同藜麥加工方法處理后的藜麥中皂苷的殘留情況進行了考察，可為以后大規模提取利用藜麥皂苷打下一定的基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

藜麥為青藜一號產自青海省海西蒙古族藏族自治州都蘭縣，平均海拔3 100m；齊墩果酸對照品（批號110709-200505）：中國食品藥品檢定研究院；藜麥皂苷A對照品：青海高遠錦禾生態農牧科技有限公司制備；香草醛、乙醇、甲醇、冰醋酸、高氯酸：均為分析純；實驗室用水為超純水。

1.2 儀器設備

Lambda35紫外可見分光光度計：美國PE公司；HH-2數顯恒溫水浴鍋：常州智博瑞儀器制造有限公司；101-1S電熱鼓風干燥箱：邦西儀器科技（上海）有限公司；FA2004電子分析天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；JP-030S超聲波清洗機：深圳市潔盟清洗設備有限公司；RE-52AA旋轉蒸發器：上海亞榮生化儀器廠；SHA-C水浴恒溫振蕩器：上海華鄰實業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

藜麥籽實中的皂苷為三萜皂苷[10]，以往在沒有藜麥皂苷對照品的情況下通常選用齊墩果酸為對照品[11-12]，但藜麥皂苷的分子量因含有糖苷配基一般在700以上，而齊墩果酸不含糖苷配基分子量為456.71，故分別使用藜麥皂苷A和齊墩果酸作為對照品進行比較。藜麥皂苷A分子結構見圖1，分子量810.44。

圖1 藜麥皂苷A分子結構Fig.1 M olecular structureof quinoa saponinsA

準確稱取齊墩果酸對照品10.1mg，置50mL量瓶中加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成0.202mg/mL的標準儲備溶液。

準確稱取藜麥皂苷A對照品6.60mg，置25mL量瓶中加甲醇溶解并稀釋至刻度，制成0.264mg/mL的標準儲備溶液。

1.3.2 標準曲線

分別精密量取齊墩果酸標準儲備溶液各0、50、100、200、400μL和藜麥皂苷A標準儲備溶液各0、400、600、800、1 000、1 200 μL 置于干燥的具塞試管中，60℃蒸干，取出放冷，依次加入5%香草醛冰醋酸溶液0.2mL和高氯酸0.8mL，搖勻，于60℃水浴中保溫15min，取出，用冰水浴冷卻10min，加入4mL冰醋酸，搖勻。選取齊墩果酸400μL的標準溶液和藜麥皂苷A 400μL的標準溶液，于400 nm～760 nm范圍進行掃描，選定最大吸收波長為測定波長。在最大吸收波長處測定各標準溶液的吸光度A，以吸光度A為縱坐標，以相應對照品濃度（mg/mL）為橫坐標，分別繪制標準曲線。

1.3.3 供試品溶液的制備

1.3.3.1 以齊墩果酸為對照品的方法

將一定量的藜麥種子粉碎成藜麥粉，分別稱取藜麥粉6份，每份5 g，置于錐形瓶中，按料液比1∶30（g/mL）加入70%乙醇溶液，50℃振蕩提取24 h，抽濾得到濾液即為供試品溶液。

吸取供試品溶液400μL，采用與標準溶液相同的方法測定其吸光度值。根據標準曲線求出測定樣品中皂苷的質量（m），按照公式求出藜麥中總皂苷的含量。

式中：m為供試液樣品中總皂苷質量，mg；V為供試液總體積，mL；M為藜麥總質量，g；v為供試液取樣體積，mL。

1.3.3.2 以藜麥皂苷A為對照品的方法

分別稱取粉碎好過60目篩的藜麥粉6份，每份1 g，置于100mL錐形瓶中，加入60%乙醇溶液30mL，超聲提取30min，4 000 r/min離心5min，取上清液，殘渣重復提取一次，合并上清液回收乙醇至無醇味，用水飽和的正丁醇萃取4次，每次10mL，合并萃取液，揮干溶劑，殘渣用甲醇溶解，轉移至50mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為供試品溶液。精密量取供試品溶液400μL，置于具塞試管中，60℃蒸干，取出放冷，采取與標準溶液相同的方法測定其吸光度A。根據標準曲線查得供試品溶液中總皂苷的濃度（mg/mL），按照公式計算出藜麥中總皂苷的含量。

式中：C為供試品溶液中總皂苷的濃度，mg/mL；V為供試品溶液的總體積，mL；W為藜麥重量，g。

1.3.4 不同測定方法含量測定結果的比較

分別按文獻報道方法和本次試驗采用的方法稱取粉碎好的藜麥粉各6份，測定其藜麥總皂苷的含量，比較兩種方法測定的差異。

1.3.5 不同加工工藝去除藜麥皂苷

由于藜麥皂苷是一種抗營養物質[13-14]，并且具有苦澀的味道，因此食用前需盡可能除去[15]。藜麥籽實中的皂苷主要來源于殼中，脫殼會去除大量皂苷，通常采用濕法、干法和混合法去除藜麥籽實中的皂苷。濕法需要使用大量的水洗滌[16]，水質污染問題是其主要的問題。干法是使用機器碾磨籽實去除藜麥皂苷，一般干法更為經濟、簡單、無污染，但效果較差，僅能去除80%的皂苷[17]，一些營養物質也會流失。混合法先快速碾磨籽實，然后簡單沖洗，避免了營養的流失也降低了水中皂苷的含量。通過對濕法和混合法處理后藜麥籽實中皂苷含量的測定，確定最佳的加工工藝。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的測定

有文獻報道[11]，齊墩果酸采用的檢測波長為560nm，齊墩果酸標準溶液紫外光譜圖見圖2。由圖2可知，紫外光譜圖中齊墩果酸對照品在400 nm～760 nm處的最大吸收波長為545 nm，因此，選用545 nm作為檢測波長，藜麥皂苷A標準溶液紫外光譜圖見圖3。由圖3可知，藜麥皂苷A對照品在400 nm～760 nm處的最大吸收波長為482 nm，因此，選用482 nm作為檢測波長。

圖2 齊墩果酸標準溶液紫外光譜圖Fig.2 Ultraviolet spectrum of oleanolic acid

圖3 藜麥皂苷A標準溶液紫外光譜圖Fig.3 Ultraviolet spectrum of quinoa saponins A

2.2 標準曲線的繪制

通過數據處理得到的齊墩果酸標準溶液回歸方程為：A=48.171C，r=0.997 2，在 0.004 04 mg/mL～0.040 4mg/mL范圍內線性關系良好。

通過數據處理得到的藜麥皂苷A標準溶液回歸方程為：A=11.811C，r=0.995 1，在 0.021 12mg/mL～0.063 36mg/mL范圍內線性關系良好。

2.3 不同方法含量測定結果的比較情況

不同方法藜麥皂苷含量測定結果見表1。

表1 不同方法藜麥皂苷含量測定結果Table1 The resultof determ ination of quinoa saponin by diferentmethods

采用t檢驗，計算得t值為66.653，查t檢驗臨界值表得 t0.05，10=2.228，t＞t0.05，10，說明兩種方法測得的含量均值存在顯著性差異。

2.4 不同加工工藝去除藜麥皂苷效果

藜麥籽實經不同加工工藝后總皂苷含量測定結果見表2。

表2 藜麥籽實經不同加工工藝后總皂苷含量測定結果Table2 The resultof determ ination of totalsaponin in quinoa after different processing

從表2可以看出，碾磨加工后藜麥籽實中皂苷的量減少了一半，隨著水洗次數的增加皂苷的量也不再明顯減少，說明皂苷主要集中在籽實的外殼中，通過碾磨能有效的去除皂苷。單純水洗也能夠去除藜麥中的皂苷，隨著清洗次數的增加，皂苷的量呈現逐漸降低的趨勢，當清洗2次后皂苷的量不再明顯降低，清洗2次就可以除去大部分皂苷。對碾磨后分離得到的種皮粉末中的皂苷含量進行檢測，平均含量為100.35mg/g，是未加工藜麥籽實中皂苷含量的4倍。

3 結論與討論

藜麥皂苷味苦，是藜麥中主要的抗營養物質，在藜麥籽實中含量較高[18]不利于作為食物和飼料應用。同時皂苷類物質具有一定的生物活性[19-21]，可用于藥品[22]、保健食品、化妝品、生物農藥、食品添加劑使用[23-24]，因此建立一種簡便、可靠的藜麥皂苷測定方法十分必要。采用超聲波提取，香草醛-高氯酸比色法測定藜麥中皂苷含量，以藜麥皂苷A為對照品，檢測波長482 nm，樣品提取采用60%乙醇溶液，料液比1 ∶30（g/mL），提取時間 30min，連續提取 2 次的方法能夠測得藜麥中總皂苷含量。

濕法去除藜麥籽實中的皂苷效果較好，能最大程度的去除皂苷，但水質污染是其存在的主要問題，并不適用于大規模生產的應用。混合法去除藜麥籽實中的皂苷，通過碾磨步驟就能夠去除大部分的皂苷，只需通過一次水洗就能夠去除籽實表面殘留的種皮粉末，適合大規模生產的應用。

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