毛冬青葉多酚的提取工藝及其抗氧化性質(zhì)的研究

唐婷范，杜丹丹，鄧起東，姚增輝，田玉紅

（廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西柳州545006）

毛冬青（Ilex pubescens Hook.et Arn），是屬于冬青科冬青屬常綠灌木或小喬木，它在我們生活中還被我們叫做烏尾丁、美仔蕉等。已對(duì)毛冬青根的化學(xué)成分、藥理活性及臨床應(yīng)用等方面進(jìn)行了比較系統(tǒng)的探討，其化學(xué)成分包括黃酮、香豆素、萜烯、酚類物質(zhì)、甾體、單寧、糖、氨基酸等[1-8]，毛冬青根資源有限，且不可再生，而葉資源豐富，且為可再生資源。但至今國內(nèi)罕有文獻(xiàn)對(duì)毛冬青葉的化學(xué)成分進(jìn)行報(bào)道[9-10]，《浙江民間常用草藥》記錄：黑色尾葉，味苦，清熱，消炎；治療牙周炎，牙周炎瘡，帶狀皰疹，膿皰瘡[11]。

多酚是一類廣泛存在于植物中的化合物。大量的數(shù)據(jù)表明植物多酚具有重要的生理活性。抗氧化，抗氧化，抗腫瘤，抗腫瘤和抗心腦血管疾病具有顯著的效果，作為功能性食品添加劑，可廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥領(lǐng)域[12]。21世紀(jì)以來，國內(nèi)外在植物多酚方面的探討報(bào)道較多[13-15]，但有關(guān)毛冬青葉多酚的探討鮮見報(bào)道，為了綜合利用資源，擴(kuò)大藥源，為毛冬青葉的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)，本試驗(yàn)對(duì)毛冬青葉多酚提取工藝及提取液的抗氧化活性進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

毛冬青葉：產(chǎn)于云南。沒食子酸、羅氏鹽、酸性磷酸鈉、磷酸氫二鈉、燒堿、香蘭素、H2O2、綠礬、鄰羥基苯甲酸（均為國產(chǎn)分析純）：西隴科學(xué)股份有限公司；二苯基苦基肼自由基DPPH·（分析純）：Wako公司產(chǎn)品；D301大孔樹脂：滄州寶恩吸附材料科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550紫外可見分光光度計(jì)：日本島津公司；Paragon500 FTIR紅外光譜儀：美國PerkinEImer；722N可見分光光度計(jì)、pHS-3C型精密pH計(jì)、電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司：RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 毛冬青葉多酚成分的提取

按照參考文獻(xiàn)[16]將毛冬青葉烘干粉碎，過20目篩。準(zhǔn)確稱取一定量的原料，加入一定料液比的浸提溶劑，于一定溫度下回流浸提一定時(shí)間，浸提液在3 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心20min，取上清液用722 N可見分光光度計(jì)測(cè)定吸光度，將浸提液濃縮后真空干燥，干燥物置于4℃～6℃冰箱中保存，等待使用。

1.3.2 毛冬青葉抗氧化成分析

采用特征顯色反應(yīng)（分別與明膠、三氯化鐵、甲醛-鹽酸和茴香醛-硫酸試劑反應(yīng)）[17]、采用D301樹脂對(duì)提取液純化后進(jìn)行紫外可見吸收光譜和紅外光譜定性分析。

1.3.3 多酚含量的測(cè)定

按參考文獻(xiàn)[18]配制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，以酒石酸亞鐵為顯色劑，采用分光光度法對(duì)毛冬青葉多酚得率進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4 毛冬青葉中多酚化合物的抗氧化性質(zhì)

將浸提的毛冬青葉多酚配成不等同質(zhì)量濃度的水溶液，分別運(yùn)用Fenton與DPPH法[19]，測(cè)定各試樣不等同濃度時(shí)的A525nm與A517nm，并計(jì)算其對(duì)OH自由基和DPPH自由基的消除率。

2 結(jié)果與討論

2.1 毛冬青葉抗氧化成分表征

2.1.1 特征顯色反應(yīng)

提取液與顯色劑的顯色反應(yīng)結(jié)果如表1所示。

表1 提取液的顯色反應(yīng)Table1 Colour developm ent reaction of extraction

由表1可知，提取液具有多酚的顯色特征，初步推斷出毛冬青葉中含有酚羥基類成分。

2.1.2 紫外可見光及紅外光譜分析

對(duì)毛冬青葉提取物進(jìn)行紫外可見光和紅外光譜分析，結(jié)果見圖1。

圖1 試樣的紫外可見光和紅外光譜分析圖Fig.1 UV absorption and FT-IR spectrum of samples

紫外可見光光譜圖1（a）以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照。從圖1可知，毛冬青葉提取液與沒食子酸在260nm處均有強(qiáng)吸收，可推斷毛冬青葉含多沒食子酸為主的多酚類化合物。

紅外光譜如圖1（b）以沒食子譜圖為參照。從圖1可知，提取物具有沒食子酸多酚類的部分特征吸收峰，如3 400 cm-1處有很強(qiáng)的O-H伸縮振動(dòng)，峰形寬大，吸收峰強(qiáng)，3 063 cm-1～2 978 cm-1為羧基O-H伸縮振動(dòng)，1 322 cm-1為O-H面內(nèi)彎曲振動(dòng)，1 703 cm-1為羧基C=O伸縮振動(dòng)，766 cm-1有芳香環(huán)的不飽和C-H面外變形振動(dòng)產(chǎn)生的吸收，642 cm-1為O-H面外彎曲振動(dòng)，1 600 cm-1左右為苯環(huán)骨架吸收峰等，由此分析可大致認(rèn)為毛冬青葉抗氧化主要成分為沒食子酸類多酚物質(zhì)[20]。

綜合以上試驗(yàn)結(jié)果可初步推斷，試驗(yàn)提取得到的毛冬青葉抗氧化成分可能屬于水解單寧類化合物，但其具體種類及結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步確定。

2.2 毛冬青葉多酚的定量分析

2.2.1 沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，在濃度為0～12μg/mL范圍內(nèi)，吸光值與濃度程直線關(guān)系，結(jié)果見圖2。

圖2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curveof pyrogallic acid

回歸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=0.018 94x+0.007 37，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 1，式中：x為沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，μg/mL；y為吸光度A。

2.2.2 精密度、重現(xiàn)性和加標(biāo)回收結(jié)果

精密度試驗(yàn)按1.3.1方法制備一份樣品溶液，來回測(cè)定6次，計(jì)算RSD，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab le2 Resultsof precision experiments（n=6）

由表2可知，精密度試驗(yàn)的RSD為1.51%，表明該測(cè)定方法的精密度良好。重現(xiàn)性試驗(yàn)：在同一要求下，回流浸提得到6份浸提液，測(cè)定并計(jì)算RSD，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Table3 Resultsof reproducibility experiments（n=6）

由表3可知，穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD為1.41%，表明該測(cè)定方法比較穩(wěn)定。

加標(biāo)回收試驗(yàn)：精密量取相同體積樣品溶液5份，分別加入不等同體積的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定總多酚含量，按回收率/%=（實(shí)測(cè)值－樣品所含的總多酚）/加入的沒食子酸標(biāo)樣×100計(jì)算，得到平均回收率和RSD，試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=5）Table4 Resultsof recovery experim ents（n=5）

由表4可知，平均加標(biāo)回收率為98.68%，RSD為1.17%。以上結(jié)果表明，該測(cè)定方法的精密度、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度良好，適用于毛冬青葉多酚含量的測(cè)定。

2.3 毛冬青葉多酚提取條件優(yōu)化

2.3.1 溶劑pH值對(duì)多酚得率的影響

稱取2.0 g毛冬青葉，加入料液比為1∶30（g/mL），不一樣pH值（3～10）的水，于50℃溫度下回流提取1次（2 h），結(jié)果如圖3所示。

pH=4中多酚的得率高，可能是由于多酚類物質(zhì)普遍與植物中的堿有關(guān)。適量的酸，容易釋放酚酸，對(duì)于高聚合度的縮合，冷凝液比酸溶液更容易浸出，但它易于氧化多酚，因此，pH=4的蒸餾水是在下面的試驗(yàn)進(jìn)行的。

圖3 溶劑pH值對(duì)多酚得率的影響Fig.3 Theeffectof pH valueon yield of polyphenol

2.3.2 提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響

首先稱2.0 g毛冬青葉，然后加入料液比為1∶30（g/mL）的水，其中pH=4，于50℃下分別以不同時(shí)間回流提取1次，結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取時(shí)間對(duì)多酚得率的影響Fig.4 Theeffectof extraction timeon yield of polyphenol

1.5 h內(nèi)隨著提取時(shí)間的增加，多酚的得率大大提高。在那之后，它顯然呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。可能的原因是，在初始階段，多酚的擴(kuò)散速度較快，多酚的得率較高。1.5 h的擴(kuò)散趨于平衡，浸出率降低。一些酚類物質(zhì)被認(rèn)為是很容易被氧化在空氣中，故提取時(shí)間以1.5 h為宜。

2.3.3 提取溫度對(duì)多酚得率的影響

稱取2.0 g毛冬青葉，加入料液比為1∶30（g/mL）的水（pH=4）。同時(shí)，于不同溫度下回流提取1次（1.5 h），結(jié)果如圖5所示。

多酚化合物的得率隨溫度的升高而增加。當(dāng)溫度達(dá)到50℃時(shí)，多酚的得率明顯降低。可能是因?yàn)闇囟壬撸軇┑臐B透能力和溶解性得到了提高，但多酚的過度氧化造成了生物活性的喪失，因此可取的提取溫度為50℃最合適。

多酚化合物的得率隨溫度的升高而增加。當(dāng)溫度達(dá)到50℃時(shí)，多酚的得率明顯降低。可能是因?yàn)闇囟壬撸軇┑臐B透能力和溶解性得到了提高，但多酚的過度氧化造成了生物活性的喪失，因此可取的提取溫度為50℃最合適。

圖5 提取溫度對(duì)多酚得率的影響Fig.5 The effect of extraction temperature on yield of polyphenol

2.3.4 提取料液比對(duì)多酚得率的影響

稱取2.0 g毛冬青葉，加入不同料液比的水（pH=4），于50℃下回流提取1次（1.5 h），結(jié)果如圖6所示。

圖6 料液比對(duì)多酚得率的影響Fig.6 Theeffectof ratio of liquid to solid on yield of polyphenol

隨著液料比例的增加，多酚的溶出速率也在增加，原因可能是液體比例的增加將大大提高傳質(zhì)率和傳質(zhì)力。當(dāng)料液比為1∶30（g/mL）時(shí)，多酚得率達(dá)到最大。之后，多酚的得率隨著固液平衡的增加而降低，有吸附和吸附的平衡，低溫有利于吸附。隨著溶劑用量的增加和相同量的熱，提取液的溫度下降和吸附能力的提高，導(dǎo)致多酚的得率下降。同時(shí)考慮到溶劑用量過大，增加后續(xù)試驗(yàn)的工作量。因此，以1∶30（g/mL）為合適的料液比。

2.3.5 提取次數(shù)對(duì)多酚得率的影響

稱取2.0 g冬青葉（過20目），加入料液比為1∶30（g/mL）的水（pH=4），于50℃下回流浸提不同次數(shù)，每次浸提1.5 h，結(jié)果如圖7所示。

提取次數(shù)為1次時(shí)，多酚得率約為2.59%，第2次得率為2.91%，得率也比第1次提高0.32%，提取3次～5次時(shí)，得率基本趨于平緩。可能是因?yàn)榈?、2次提取時(shí)，毛冬青葉中的多酚已經(jīng)基本溶解到溶劑里面了，由此看來，毛冬青葉提取1次之后，如果再次提取的話，沒有很大的實(shí)際意義，加上考慮成本因素，故提取次數(shù)1次為佳。

圖7 提取次數(shù)對(duì)多酚得率的影響Fig.7 Theeffectofextraction timeson yield of polyphenol

2.3.6 毛冬青葉多酚的正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇前4個(gè)因素進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，方案如表5所示。

表5 正交試驗(yàn)因素水平表Table5 Factorsand levelsof orthogonalexperiment

以毛冬青葉多酚得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)化總多酚的最適合提取工藝，結(jié)果見表6。

表6 正交試驗(yàn)及其結(jié)果分析Tab le6 Resultsof theorthogonalexperiment

續(xù)表6 正交試驗(yàn)及其結(jié)果分析Continue table6 Resultsof theorthogonalexperiment

由直觀剖析可以得到，2號(hào)試驗(yàn)的結(jié)果顯示的是最適合，其相對(duì)應(yīng)的優(yōu)化組合為A1B2C2D2；由極差R剖析可以得到，毛冬青葉多酚浸提要求因素的主次順序?yàn)榻釙r(shí)間＞pH值＞浸提溫度＞料液比。根據(jù)正交要求的統(tǒng)一比較，各因素的最佳組合是最優(yōu)水平組合，即B2D2A2C2。試驗(yàn)結(jié)B2D2A2C2條件下提取的多酚得率最高為2.89%，這次測(cè)定的含量均高于之前每次試驗(yàn)測(cè)定的含量是最適合的結(jié)果。

2.4 毛冬青葉多酚的抗氧化性研究

毛冬青葉多酚對(duì)·OH的清除作用，以沒食子酸做對(duì)照，結(jié)果如圖8所示。

圖8 不同濃度試樣對(duì)·OH清除率曲線Fig.8 Hydroxyl free radicalscavenging ratesof differentsam ples

在較低濃度時(shí)，樣液的清除作用較弱，但隨著其濃度增加，清除作用快速增強(qiáng)。當(dāng)濃度達(dá)到1.5mg/mL時(shí)，樣液的清除能力基本不變，可能原因是試液中的有效物質(zhì)被氧化。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，樣液是在1.5mg/mL時(shí)對(duì)·OH有最大清除率，清除率為55.00%。樣液和沒食子酸溶液在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)·OH清除作用變化趨勢(shì)相似。由此可知，樣液和沒食子酸一樣，含有供氫體，可還原氧化性的自由基，從而能終止自由基連鎖反應(yīng)，以清除自由基。毛冬青葉多酚對(duì)DPPH·的清除作用，以沒食子酸做對(duì)照，結(jié)果如圖9所示。

在較低濃度時(shí)，樣液對(duì)DPPH·有很高的清除率，且清除效果與標(biāo)準(zhǔn)液的清除效果變化趨勢(shì)相同，當(dāng)濃度達(dá)到1mg/mL時(shí)，但清除率增加幅度不大。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，樣液對(duì)DPPH·的清除率的最大值為62.85%。

圖9 不同濃度試樣對(duì)DPPH·的清除率曲線Fig.9 DPPH free radicalscavenging ratesof differentsam ples

3 結(jié)論

毛冬青葉中含多酚類抗氧化成分，且最適合浸提工藝要求下多酚得率為2.89%。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，該多酚提取液對(duì)·OH與DPPH·的清除率分別達(dá)55.00%與62.85%，具備一定的清除自由基作用。

采用的回流浸提方法，其具備操作簡單，方法穩(wěn)定的特點(diǎn)，另外烏尾丁葉多酚具備一定的抗氧化作用，近年來，隨著植物抗氧化成分的發(fā)展，食物中的植物抗氧化物質(zhì)，因此，化妝品和藥物的使用日益增多，因此，作為功能性食品添加劑的多酚類食品具有廣泛的應(yīng)用和發(fā)展前景。這對(duì)毛冬青的綜合利用和進(jìn)一步發(fā)展具有重要意義。

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