超聲波處理對花生蛋白分子結(jié)構(gòu)的影響

張文，張麗芬，陳復生，王培

（河南工業(yè)大學糧油食品學院，河南鄭州450001）

花生是全球四大油料作物之一，在世界農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和貿(mào)易中占有重要地位?；ㄉ械鞍缀繛?5%～35%，是植物蛋白質(zhì)的第三大重要來源，占世界蛋白質(zhì)供應量的11%，其營養(yǎng)價值與動物蛋白相似，且不含膽固醇，是一種較理想的可食用蛋白質(zhì)資源[1]。但相對于大豆蛋白，花生蛋白的功能性質(zhì)如乳化性、起泡性和凝膠性質(zhì)都比較差，極大限制了其在食品領(lǐng)域的使用[2]。研究超聲波處理對花生蛋白分子結(jié)構(gòu)的影響，對于改變花生蛋白的功能特性進而拓寬花生蛋白的應用領(lǐng)域具有重要的意義。

超聲波是一種高效可靠的改變蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的方法，它產(chǎn)生的機械效應和空化作用能夠破壞天然蛋白質(zhì)分子之間的非共價相互作用，使肽鍵斷裂并誘導亞基解離或聚集，導致蛋白質(zhì)功能特性的變化[3]。相較于傳統(tǒng)的幾種物理改性方法如加熱、冷凍、微波、高速攪拌處理和高壓均質(zhì)等，超聲波具有快速有效的改性效果且不損失營養(yǎng)物質(zhì)以及無毒無害等優(yōu)點[4]。石燕等認為超聲波處理后酪蛋白某些功能性質(zhì)如起泡性和乳化性等改善，可能是超聲波作用使酪蛋白分子中的螺旋結(jié)構(gòu)部分展開，蛋白質(zhì)分子的柔順性增加所致[5]。此外，Zhang等研究發(fā)現(xiàn)超聲波處理后花生蛋白的表面疏水性增加的同時有助于提高其乳化性能，其原因可能是超聲作用誘導蛋白質(zhì)解折疊，暴露出更多的疏水基團[6]。利用超聲波這種新型物理改性方法，能有效改善花生蛋白的功能性質(zhì)。但目前國內(nèi)外對花生蛋白的改性研究主要集中在理化和功能性質(zhì)方面，就超聲波改性對花生蛋白分子結(jié)構(gòu)的影響鮮有報道。因此，本文以花生蛋白粉為原料，通過HPLC、SDS-PAGE和FT-IR等方法研究了超聲波改性后花生蛋白分子結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，研究結(jié)果為超聲波技術(shù)在蛋白質(zhì)改性領(lǐng)域的應用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

帝心花生蛋白粉（花生蛋白樣品蛋白含量為42.75%，純化后樣品蛋白含量為70.55%）：河南帝鑫食品有限公司；SCIENTZ-IID型超聲波細胞粉碎機、DC-2006節(jié)能型智能恒溫槽：寧波新芝生物科技股份有限公司；90-2型恒溫磁力攪拌器：上海亞榮生化儀器廠；GL-20C型高速冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計：北京譜析通用儀器有限公司；DDY-6D型電泳儀：北京市六一儀器廠；LGJ-25型冷凍干燥機：北京四環(huán)科學儀器廠有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的純化

花生蛋白粉→按料液比1∶8（g/mL）加入稀堿液（pH 8.0）→攪拌分散→離心20min（4 000 r/min）→取上清液→調(diào)pH值至4.5→離心15min（4 000 r/min）→收集沉淀→水洗后離心→調(diào)pH值到7.0→沉淀復溶→4℃透析24 h→冷凍干燥→樣品保存至4℃?zhèn)溆?/p>

1.2.2 花生蛋白溶液的配置

將6 g花生蛋白粉溶于1 L pH 8.0的NaOH溶液，在25℃下以300 r/min的轉(zhuǎn)速磁力攪拌2 h使花生蛋白均勻分散，待用。

1.2.3 超聲波處理

將超聲波探頭置于花生蛋白懸浮液（70mL）液面下方3 cm處，恒溫水槽控制溫度，設(shè)置超聲波占空比為50%，超聲功率分別為336、672、1 008、1 344、1 680W/cm2；時間為 10、20、30、40、50min；溫度為 5、15、25、35、45 ℃，超聲波處理樣品凍干備用。

1.2.4 高效凝膠滲透色譜（SE-HPLC）

采用TSK SEC 4000柱對標準蛋白進行分離。洗脫液為色譜級乙腈和娃哈哈純凈水（含0.05%三氟乙酸）（體積比），采樣時間為25min。在280 nm的波長下進行蛋白質(zhì)的檢測。標準蛋白的分子量（kDa）如下所述：核糖核酸酶 A（13.7），卵清蛋白（44.3），醛縮酶（150）和甲狀腺球蛋白（670）。每個樣品平行測量3次。標準曲線：log（M）=-0.290 92x+4.714 5；R2=0.990 6。式中：x為出峰保留時間；M為標準蛋白分子質(zhì)量。

1.2.5 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）

SDS-PAGE電泳依照Laemmli的方法改進[7]。制備12%的分離膠，4%的濃縮膠進行電泳。將樣品溶解于pH=8的NaOH溶液后與樣品緩沖液 （pH=6.8的0.5mol/LThis-HCl，巰基乙醇，10%SDS 溶液，0.5%的溴酚藍，甘油，蒸餾水）按1∶1的體積比混合，然后沸水浴4min。取10μL處理后的樣品上樣，采用低分子量蛋白 markers（14 400Da～97 400Da）作為對照。電極緩沖液為 0.025mol/LTris、0.1%SDS、0.192mol/L 甘氨酸緩沖液，先將電流調(diào)至20mA進行電泳，至溴酚藍前沿進入分離膠，再將電流調(diào)至30mA下進行1.5 h。電泳結(jié)束后，采用考馬斯亮藍R-250染色1.5 h，再用脫色液（95%乙醇、冰醋酸、蒸餾水按體積比25∶8∶67混合）進行脫色，直至可以清楚地辨別條帶為止。

1.2.6 傅里葉紅外光譜（FT-IR）分析

將1mg干燥后的花生蛋白樣品與100mg干燥的溴化鉀研磨至完全均勻，通過HY-12型壓片機和壓片模具，將樣品混合物壓制成透明薄片，掃描其紅外光譜。在分辨率4 cm-1、掃描次數(shù)16次的條件下，采用全反射裝置測定透明薄片在400 cm-1～4 000 cm-1范圍內(nèi)的吸收。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲波對花生蛋白分子量及其分布的影響研究

2.1.1 超聲波強度對花生蛋白分子量分布的影響研究

超聲波強度對花生蛋白分子量分布的影響如表1所示。

表1 超聲波強度對花生蛋白分子量分布的影響Table 1 Effectofultrasound intensity on themolecular weight distribution of peanut protein

由表1可知，花生蛋白的分子量主要分布在279.76 kDa～670.00 kDa和 13.69 kDa～54.75 kDa范圍之間。隨著超聲波強度的增大，分子量大于279.76 kDa的蛋白片段整體呈增加趨勢，而分子量介于13.69 kDa～54.75kDa之間的蛋白片段減少，且分子量小于13.69kDa的蛋白片段隨超聲波強度的增強先增加后減少。結(jié)果表明，低強度超聲波處理花生蛋白有小片段生成，而較高強度超聲波處理可能會使蛋白發(fā)生聚集，生成大分子量的蛋白片段。此試驗結(jié)果與孫英杰等的研究結(jié)果一致[8]。

2.1.2 超聲波時間對花生蛋白分子量分布的影響研究

超聲波時間對花生蛋白分子量分布的影響如表2所示。

表2 超聲波時間對花生蛋白分子量分布的影響Tab le2 Effectof ultrasound tim eon themolecularweight distribution of peanut protein

由表2可知，隨超聲波時間的延長，分子量在670.00 kDa以上的蛋白片段顯著增加，而分子量分布在13.69 kDa～54.75 kDa范圍之間的蛋白片段逐漸減少，且在超聲時間為50min時達到最低值；此外，與空白樣品相比，超聲處理后的花生蛋白在分子量低于13.69 kDa處有新片段產(chǎn)生，說明超聲作用使蛋白質(zhì)的肽鍵斷裂，促進了小分子的產(chǎn)生，但長時間的超聲作用產(chǎn)生瞬時極端溫度和壓力導致蛋白變性，暴露出疏水基團使蛋白質(zhì)產(chǎn)生聚集[9]。

2.1.3 超聲波溫度對花生蛋白分子量分布的影響研究

不同超聲波溫度處理下的花生蛋白分子量分布如表3所示。

由表3可知，與空白相比較，隨超聲波溫度的升高分子量在279.76 kDa～670.00 kDa的蛋白片段增加，并在超聲溫度為45℃時達到最大為43.84%；而分子量分布在13.69 kDa～279.76 kDa范圍之間的蛋白片段則逐漸減少，且超聲溫度為25℃時有少量小分子量片段生成。試驗結(jié)果表明，花生蛋白部分亞基發(fā)生了降解，而大分子量片段的生成可能是加熱過程中R基基團發(fā)生聚合現(xiàn)象[10]。

表3 超聲波溫度對花生蛋白分子量分布的影響Table3 Effectofultrasound temperatureon themolecularweight distribution of peanut protein

2.2 超聲波處理對花生蛋白亞基的影響研究

超聲波處理對花生蛋白亞基的影響見圖1。

圖1 超聲波處理對花生蛋白亞基的影響Fig.1 Effectof u ltrasound on the subunitsof peanut protein

2.2.1 超聲波強度對花生蛋白亞基的影響研究

如圖1A所示為不同超聲波強度處理后花生蛋白樣品的SDS-PAGE電泳圖。該花生蛋白呈現(xiàn)出典型的花生球蛋白、伴花生球蛋白Ⅰ和伴花生球蛋白II。與未經(jīng)超聲波處理的花生蛋白相比，不同超聲波強度處理的花生蛋白條帶分布沒有明顯的變化，說明超聲波強度對花生蛋白亞基沒有顯著地影響。

2.2.2 超聲波時間對花生蛋白亞基的影響研究

如圖1B所示為不同超聲波時間處理后花生蛋白樣品的SDS-PAGE電泳圖。與未經(jīng)超聲波處理的花生蛋白相比，不同超聲波時間處理的花生蛋白在分子量為66.2 kDa附近條帶增加，且在分子量為14.4 kDa處形成新條帶。可能是超聲波作用破壞了天然蛋白聚集顆粒間的非共價作用，并使其肽鍵斷裂，導致部分蛋白亞基產(chǎn)生了不可逆降解[11]，但隨超聲波時間的延長蛋白質(zhì)變性發(fā)生聚集現(xiàn)象。此試驗結(jié)果與超聲波時間對花生蛋白分子量分布的影響結(jié)果一致。

2.2.3 超聲波溫度對花生蛋白亞基的影響研究

如圖1C所示為不同超聲波溫度處理后花生蛋白樣品的SDS-PAGE電泳圖。與空白相比，分子量在66.2 kDa附近的條帶有所增加，說明有大分子量的片段生成，可能是超聲波作用產(chǎn)生的瞬時極端溫度和壓力共同導致蛋白質(zhì)變性，暴露出更多的疏水集團導致蛋白質(zhì)的聚集。

2.3 超聲波處理對花生蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響研究

2.3.1 超聲波處理對花生蛋白紅外光譜特性的影響研究

超聲波處理對花生蛋白紅外光譜特性的影響見圖2。

圖2 超聲波處理對花生蛋白FT-IR光譜特性的影響Fig.2 Effectof u ltrasonic treatmenton the FT-IR spectra of peanut protein

由圖2可知，花生蛋白的酰胺I帶（1 700 cm-1～1 600 cm-1）信號較強，由羰基（C=O）鍵伸縮振動產(chǎn)生，其峰型受蛋白質(zhì)特定二級結(jié)構(gòu)影響[12]。隨超聲波作用強度的增大和溫度的升高，酰胺I帶吸收峰發(fā)生藍移，可能是超聲波的空化作用和高溫破壞了蛋白質(zhì)分子內(nèi)氫鍵，使峰位向高波的方向移動[13]。由圖2A與2C可以看出，隨超聲波強度和溫度的增加2 400 cm-1附近的吸收峰逐漸減弱甚至消失，可能是由于高強度超聲使花生蛋白肽鍵斷裂，導致其結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變[14]；而圖2B中此處的吸收峰卻隨超聲時間的延長逐漸增強，可能是蛋白質(zhì)的聚集所致。

2.3.2 超聲強度對花生蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響研究

根據(jù)已有研究，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)與各子峰間的對應關(guān)系為[15]：α-螺旋結(jié)構(gòu)對應波數(shù)1 650 cm-1～1 658 cm-1，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)對應波數(shù) 1 660 cm-1～1 700 cm-1，無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)對應波數(shù) 1 640 cm-1～1 650 cm-1，β-折疊結(jié)構(gòu)對應波數(shù)為1 610 cm-1～1 640 cm-1。采用Peakfit軟件對蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶進行傅里葉去卷積光譜擬合分析，通過峰位歸屬確定二級結(jié)構(gòu)種類和含量，計算結(jié)果見表4。

表4 超聲波對花生蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響Table4 Effectof ultrasound on thesecondary structureof peanut protein%

由表4可以看出，花生蛋白主要組成為β-轉(zhuǎn)角，占二級結(jié)構(gòu)總量的36.50%。與空白相比，超聲波處理后花生蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)比例整體呈下降趨勢，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)比例增加，超聲波處理形成的“空穴效應”及伴隨著溫度升高，對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的破壞作用比較明顯，易造成二級結(jié)構(gòu)的相互轉(zhuǎn)化[16]。而不同超聲波強度處理組之間花生蛋白二級結(jié)構(gòu)變化并無顯著差異（P＞0.05），說明超聲波強度對花生蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響并不顯著。

隨超聲波時間的延長，花生蛋白的α-螺旋、β-折疊以及無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)比例無顯著變化；而β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)比例雖逐漸減少，但其含量相比于未經(jīng)超聲波處理樣品均有不同程度增加，可能是超聲波處理使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)更加松散，導致β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)比例增加，但隨超聲波時間的延長，蛋白質(zhì)變性暴露出更多的疏水集團使蛋白質(zhì)產(chǎn)生聚集，進而使其比例減少[17]。經(jīng)不同超聲波溫度處理后，花生蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)比例有所降低，但各溫度之間并無顯著差異（P＞0.05）。當超聲波溫度為5℃時，β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)比例最大為37.04%；當溫度升高到15℃時其比例略有降低，可能是加熱過程中氫鍵斷裂所致[18]。

3 結(jié)論

超聲波改性使花生蛋白低分子量（13.69 kDa～54.75 kDa）片段分布比例降低，高分子量（＞279.76 kDa）片段分布比例增加。電泳結(jié)果顯示，超聲波作用后花生蛋白亞基片段發(fā)生了不同程度的降解，但隨超聲波作用的增強，部分蛋白質(zhì)發(fā)生了聚集。通過紅外光譜對花生蛋白二級結(jié)構(gòu)進行表征發(fā)現(xiàn)，超聲波改性后花生蛋白的α-螺旋結(jié)構(gòu)減少、β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)增加，而β-折疊和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)無顯著變化；研究結(jié)果表明，超聲波處理能夠使花生蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變?；ㄉ鞍捉Y(jié)構(gòu)的改變勢必會對其功能性質(zhì)產(chǎn)生影響，而超聲波對花生蛋白功能性質(zhì)影響的機理還有待進一步研究，以便指導超聲波技術(shù)更好地應用于蛋白質(zhì)改性領(lǐng)域。

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