原料牛奶中微生物的污染來源及檢測方法

史群杰 張麗茹 謝春勝 黃新紅 張東麗 張連潮

摘要：牛奶剛擠出時含有較少的微生物，但在不良因素的影響下，如時間的延長、環境變化以及管理不當等，會非常容易污染微生物，促使大量微生物繁殖，從而導致其酸度明顯增高或者發生酸敗等，造成牛奶質量嚴重下降，尤其是嚴重酸敗時不允許用于加工乳制品。現介紹原料牛奶中微生物的來源及檢測。

關鍵詞：原料牛奶；微生物；污染來源；標準平板計數法；聚合酶鏈式反應；DNA探針技術

中圖分類號：S81

文獻標識碼：B

文章編號：2095-9737（2018）01-0019-01

1 污染來源

乳房內的微生物。正常情況下，奶牛健康乳房中始終存在一些細菌，其通常會經由乳頭管移動到乳池下部，再隨著細菌自身的繁殖以及乳房的機械運動而移動到乳房內部。另外，由于乳頭前端非常容易侵入外界環境中的細菌，因此最先擠出的少量牛奶中一般存在較多的細菌。一般來說，乳頭管處的細菌數達到每毫升6000個左右，后面擠出的牛奶中所含的微生物數量逐漸減少，通常達到每毫升200 - 600個。但是當奶牛患有乳房炎后，因為感染病原微生物，會導致分泌牛奶中微生物水平顯著升高。

擠奶過程污染微生物。牛體的污染，是指由于自身生活習慣，經常在泥濘或者存在較多糞便的地面上走動或者臥地休息，從而導致牛蹄、軀體容易黏附大量糞便、土壤以及飼料，而這些物質中都含有很多細菌，尤其是糞便作為大腸菌的主要來源。一般來說，不清潔牛體上黏附的塵埃中，每克含有幾億至幾百億個細菌；通常每克濕牛糞含有幾十萬至幾億個細菌，每克干牛糞則含有幾億至百億個細菌。擠奶過程中，只要以上不潔物質落入牛奶中，就會產生嚴重影響。擠奶環境的污染，主要包括擠奶間的空氣、浮塵和降塵，地面的清潔程度以及蒼蠅、老鼠等病媒污染，都容易導致牛奶中微生物數量明顯增加。擠奶員的污染，即經由擠奶員雙手、衣服、頭發、呼吸以及其他錯誤操作等而導致牛奶污染，從而導致其中所含的微生物數量增多。擠奶設備的污染，是指接觸牛奶所有用具沒有進行嚴格的清洗、消毒，往往會黏附較多微生物，這也是原料牛奶中微生物的一個重要來源。

儲存、運輸過程污染微生物以及繁殖。牛奶剛擠出時的溫度一般為37—38℃，含水量為87%，加之富含營養，可作為大量細菌的繁殖培養基。尤其是當溫度升高時，會促使細菌加速繁殖，同時造成牛奶變酸發生腐敗。原料奶在運輸過程中，如果運輸容器不衛生，運輸車沒有保溫設施而導致奶溫度升高，以及劇烈震蕩等，都會促使微生物加速繁殖，從而造成原料奶發生變質。

2 常用檢測方法

標準平板計數法。取牛奶樣品充分搖勻，接著添加適量的0.85%滅菌生理鹽水制成10倍的樣品均液備用。取1 mL 10倍的樣品均液，沿著管壁緩慢注入添加有9 mL稀釋洗液的無菌試管中，充分搖勻或者用滅菌吸管多次吹打，以促使樣品充分混合，即為100倍的樣品稀釋液，并繼續通過上述方法制備一系列的樣品稀釋均液。根據原來牛奶的污染程度，通常稀釋到1000倍至10萬倍即可。一般來說，原料牛奶選擇2～3個適宜稀釋度的樣品勻液，在無菌平皿（也就是培養皿）內加入1 mL樣品勻液，注意每個稀釋度要接種兩個平皿。同時，還要在兩個滅菌的平皿內加入1 mL空白稀釋液作為空白對照。然后及時向添加有樣品稀釋液的平皿內倒入18 mL已經冷卻至46℃左右的平板計數瓊脂培養基，接著輕輕轉動平板，當凝固后翻轉平板寫上樣品編號。凝固后的全部培養皿都放在恒溫培養箱（35—37℃）中進行48 h培養。最后將培養皿全部取出，計算長出的菌落總數，并在相應樣品稀釋度上記錄。

PCR技術。即聚合酶鏈式反應，是一種體外快速擴增核酸的方法，其能夠在幾小時之內就讓原來極微量的核酸擴增達到數百萬倍以上。一般來說，只要選擇適宜的引物，PCR技術就能夠特異性地促使某- DNA片斷大量擴增達到容易檢測的水平。該技術的原理是根據DNA模板的特性，模仿其在動物體內的復制過程，在體外使用單鏈作為模板，通過人工合成引物以及耐熱聚合酶的作用進行變性、退火、延伸，從而促使目的DNA序列大量擴增，最后再通過凝膠電泳技術對DNA片段的擴增產物進行檢測。根據以上原理，能夠經由特異性地擴增某種微生物的基因片斷而達到快速檢測的目的。相比于傳統檢測方法，PCR技術具有的最大優點是準確、快速，一般只需要幾小時內就能夠實現對微生物的鑒定，但該技術只能夠在那些已知核酸序列的微生物的鑒定中應用。

DNA探針技術。DNA探針是一個被標記的較短的脫氧核糖核酸序列，其能夠與從微生物中抽提出的DNA序列進行雜交或者互補配對，也就是以C-G、A-T的方式進行配對，從而形成雙股DNA。如果DNA探針的基礎序列能夠互補于靶微生物特異性序列，則探針就只能夠與靶微生物DNA相互結合。DNA探針一共分成兩種類型，一種為無放射性標記的探針，另一種為含有放射性標記的探針。其中非放射性標記的核酸探針具有多種類型，生物素抗生物素蛋白系統標記是較為廣泛應用的一種非放射性核酸探針；放射性標記的核酸探針具有非常強的特異性，相比于常規法檢測病原微生物速度要明顯加快。