大豆異黃酮檢測方法的優化

徐佳璐

摘要：本文研究使用高效液相色譜儀對大豆中常見的四種異黃酮進行同時檢測的最佳色譜條件為：選取碳18色譜柱進行檢測，選取乙酸水溶液（0.1%）為流動相A，選取乙酸甲醇溶液（0.1%）為流動相B，以0.8 mL/min的流速依次進行梯度洗脫。設定檢測波長為260 nm，在此條件下待測組分都能夠達到比較理想的分離，計算所得的線性相關系數（R2）為大豆甙R2 =0. 9996、染料木甙R2一0. 9995、大豆苷元R2 =0. 9997、染料木素R2 =0. 9993，線性表現良好。

關鍵詞：大豆；異黃酮檢測；高效液相色譜

中圖分類號：S5 65.1

文獻標識碼：B

文章編號：2095-9737（2018）03-0011-01

1 流動相選擇

國標方法當中選用的流動相為乙腈，乙腈的毒性較大。根據乙腈的極性較強的特點，實驗中也使用強極性的流動相進行代替。為了在更短的時間內達到洗脫效果，本實驗選用了甲醇作為乙腈的替代品，采用不同濃度的甲醇水溶液及甲醇乙酸溶液作為流動相進行檢測，尋找合適的洗脫劑，使得各組分得到快速有效的分離。

2 流速選擇及梯度洗脫方案設計

流動相的流速對組分的分離效果，分離時間以及峰形都有較大的影響。流動速度加快洗脫速度，縮短洗脫時間，加快試驗速度，會使峰形變窄，但同時會使得峰與峰之間的距離縮短，流動相流動速度太快會使得組分分離不完全，但是流動相流速過快又會使得實驗時間加長，峰寬變大。本實驗中通過對流動相A和流動相B的流速進行調整，在不同的階段采用不同的流速，以求用最短的洗脫時間，達到最佳的分離效果。

3 實驗方法步驟

3.1 儀器和試劑

高效液相色譜；分析天平（0.OO01 g）；四種大豆異黃酮標準品（大豆甙、染料木甙、大豆苷元、染料木素）；甲醇（色譜純）；乙酸（色譜純）；一級實驗用水。

3.2 標準溶液配置

用分析天平（0.OO01 g）分別準確稱取四種大豆異黃酮標準品，并用甲醇水溶液（濃度為60%）配成標準儲備液（濃度為1 mg/mL）。用單標式移液管分別準確吸取四種標準儲備液于50 mL容量瓶中配置標準序列溶液，濃度分別為Oμg/mL、10.Oμ/g/mL、20.Oμg/mL、40.Oμg/mL、80.Oμg/mL、200.Oμg/mL。

3.3 實驗方案設計

流動相濃度：選取乙酸水溶液為流動相A，選取乙酸甲醇溶液為流動相B，分別配置濃度均為0.1%、0.2%、0.3%的流動相A、B；

流動相流速：分別采取0.4 mL/min、0.6 mL/min、0.8 mL/min、1.O mL/min的流速進行實驗；

梯度洗脫方案：設定流動相A和流動相B的比例：分別采取O min（50： 50），6 min（55： 45），12 min（75： 25），15 min（50：50）四個時間梯度；O min（50：50），6 min（550：45），10 min（70：30），12 min（75：25），15 min（50：50）五個時間梯度；O min（ 50： 50），4 min （55： 45），6 min（ 65： 35），10 min（70：30），12 min（75：25），15 min（50：50）六個時間梯度，分別采用三個方案進行實驗。

實驗條件：選用安捷倫碳18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫為25℃；進樣量為10 μL；檢測波長為260 nm；分別采用不同的流動相，不同的流動相速度以及采用不同的梯度洗脫方案進行實驗。每組實驗進行五次平行實驗，選取最優的效果進行比較討論。

3.4 標準曲線繪制

分別以每組實驗測得的四個組分的峰面積為縱坐標，以對應的標準序列溶液濃度為橫坐標，進行線性回歸計算，分別得到四種選取的大豆異黃酮檢測的標準曲線方程，并分別計算其線性相關系數R2。

3.5 回收率實驗

用單標線移液管分別準確吸取四種大豆異黃酮標準儲備液5 mL，6 mL、8 mL用甲醇水溶液（濃度為60%）定容至10 mL，用優化后的條件進行檢測，計算所得濃度，每個樣品做兩次平行實驗，計算本方法的回收率以評價方法的準確性。

4 數據及討論

通過計算幾組實驗的相關系數可知，以乙酸水溶液（0.1%）為流動相A，以乙酸甲醇溶液（0.1%）為流動相B，流速為0.8 mL/min，選擇五個時間梯度，在260 nm波長下進行檢測時得到的線性相關系數最好，大豆甙R2=0. 9996、染料木甙R2=0. 9995、大豆苷元R2=0. 9997、染料木素R2-0. 9993。因此在此條件下四種待測組分均達到了理想的的基線分離，四種異黃酮的峰能夠完全分離，且全部具有理想的譜峰形態。回收率實驗中四種組分的回收率分別為92%—103%、94% -105%、91% -102%、89% -107%，根據《中國藥品檢驗標準操作規程》有關規定，高效液相檢測方法的平均加樣回收率控制在80%—120%之間，均在誤差允許范圍內。

5 結論

本實驗經過優化后能夠在15 min內完成，并且根據線性相關系數和回收率實驗可以看出，本實驗所采用的檢測大豆異黃酮各個組分的方法能夠做到準確、快速定量。