中藥渣抗藥性轉化菌的篩選及酶活性測定

張義剛 聶銘 胡留杰 孫志洪 陳霞 謝永紅

摘? ?要? ?以藥渣和纖維素為唯一碳源，通過平板初篩及多種酶活綜合測定復篩，從藥渣高溫腐熟階段篩選出的復合菌系Y-5，從Y-5供試樣品中分離到能以CMC-Na作為唯一碳源生長的高溫微生物菌株72株，其中細菌54株，真菌18株，通過菌群耦合培養，獲得了結構穩定的YEM耦合菌群，對中藥渣的降解能力提高64.6%。

關鍵詞? ?中藥渣;抗藥性轉化菌;篩選

中圖分類號：S182? ? 文獻標志碼：A? ? DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.34.008

西南地區是中藥材生產和加工的核心區，如重慶太極、云南白藥和貴州百靈等幾十家全國大型中成藥制藥企業均在此設立工廠。據估計，我國中藥企業每年要消耗植物類藥材數百萬噸，隨之產生的植物類藥渣多達幾千萬噸（含水分）[1]。這些藥渣造成大量環境污染，如何有效處理是一個令人深感棘手的大問題。中藥渣中含有纖維素、半纖維素、木質素和生物堿等主要組分，其中包括難以降解的生物堿、纖維素和木質素。傳統的堆肥處理存在周期長、發酵不充分等問題，其主要原因在于藥渣具有較強的抑菌性，一般的堆肥菌劑微生物在藥渣中成活率低，生長速度慢，形成不了穩定的高活性菌群[2-3]。目前，關于纖維素降解菌和纖維素酶的研究報道較多[4-8]，主要集中于對秸稈、糞便的降解，而關于對中藥渣降解的報道則較少[9-12]。本試驗以中藥渣為降解源，擬從腐熟藥渣中初步篩選出高效無毒的抗藥性藥渣降解菌，再進行復篩，同時對其酶活性進行測定，以便開發出用于藥渣好氧堆肥處理的高效微生物菌劑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 含菌樣品

2014年5月，在太極集團涪陵制藥廠藥渣堆放區和重慶土原生物科技有限公司藥渣堆肥區，采集腐熟藥渣樣品4份及長期堆放藥渣的表層土壤4份。采集樣品后立即帶回實驗室接種，進行富集培養。

1.1.2 培養基

本試驗中使用富集培養基、CMC-Na固體培養基、纖維素-剛果紅固體培養基及液體產酶培養基等，其具體配置方法參照郭建軍等[13]。

1.2 方法

1.2.1 菌種富集

稱取菌種來源樣品5 g，加入以藥渣為唯一碳源的100 mL富集培養基中，28 ℃恒溫振蕩培養7 d，吸取5 mL培養液轉入新的富集培養基，富集3代。

1.2.2 菌種初篩和復篩

取富集3代的培養液適當稀釋，在纖維素-剛果紅固體培養基上分離純化菌種，觀察平皿上是否出現水解環及水解環的大小;初步比較不同菌株的纖維素酶酶活，并確定用于酶活測定的菌株。將分離得到的優勢菌株分別接入液體產酶培養基，在37 ℃振蕩培養4 d，將發酵液用2層紗布過濾，濾液于4 ℃、5 000 r·min-1離心20 min，上清液即為粗酶液。

1.2.3 菌群耦合培養

用產酶液體培養基將復選所得的菌株與TEM菌株等比例混合培養，形成TSM、YEM菌群，耦合菌群在2%菌種接種量、32 ℃培養溫度、每2 h通氣10 min、通氣量300 ml·min-1條件下培養5 d，測定各組合菌群的酶活性。

1.2.4 酶活性測定

采用DNS 還原糖法測定各纖維素酶酶活性，包括全酶活性（FPA）、內切酶酶活性（Cx）和外切酶酶活性（CI）[14]。

2 結果與分析

2.1 菌種初篩結果

將腐熟藥渣及堆放土壤樣品，在以藥渣為唯一碳源的培養基中進行3代富集。從藥渣高溫腐熟階段篩選出的復合菌系Y-5，在50 ℃靜止培養條件下，在第7天可使濾紙的分解率達到83%，其中對纖維素、半纖維素的分解率分別為75%、78%。復合菌系Y-5經過3次富集培養，菌系種類組成和分解能力都具有較好的穩定性，生長速度快。利用CMC分離培養基50 ℃培養分離復合菌系Y-5中的菌株，分離到能以CMC-Na作為唯一碳源生長的高溫微生物菌株72株，其中細菌54株、真菌18株，主要由芽孢桿菌屬、梭菌屬和瘤胃桿菌屬組成。分離得到的纖維素降解菌能快速地在纖維素-剛果紅固體培養基上產生清亮的水解環，其中L1和L2菌株在平板上較快地產生了較大的水解環。

2.2 菌種復篩結果

纖維素的降解是多酶體系作用的結果，選擇測定降解圈、Cx、CI、FPA 3 種酶活性大小作為菌種的復篩依據。將菌種分別接入以藥渣和CMC-Na為碳源的固體培養基和液體產酶培養基。通過CMC-Na固體培養基培養，有8個菌株快速形成菌落和CMC降解圈。菌斑測定結果（見表1）表明，L2菌落直徑最大，對CMC-Na的降解率最高，平均降解率達到4.03%;其余菌株的平均降解率均大于2%，表明8個復選菌株都具有較強的纖維素分解能力。

通過藥渣和CMC-Na 為碳源的液體產酶培養基培養5 d后的酶活測定結果見表2。對于FPA活性，以藥渣為碳源的真菌L2菌株最高，達到8.13 U·mL-1，其次較高的菌株為細菌2#、細菌5#、真菌L1和細菌3#，FPA活性均大于6 U·mL-1。以CMC-Na 為碳源的真菌L1 FPA活性最高，達到8.52 U·mL-1，其次真菌L2和細菌2#相對較高。對于Cx活性，真菌L2和細菌2#在藥渣和CMC-Na中碳源均較高，但真菌L1對藥渣的外切分解能力較弱，且它們的Cx與其他菌相比差異較大。對于CI活性，在藥渣和CMC-Na碳源中，真菌L2、細菌1#、細菌2#的活性較高，但真菌L1在外切酶和總酶活性上較差。這些表明真菌L2和細菌2#菌株降解藥渣和纖維素的能力比其他菌株要強，酶活測定結果與水解環測定結果基本吻合。

2.3 菌群耦合結果

YEM菌種培養周期為5 d，培養72 h各組合菌群的菌液OD600均達到1.25以上，活菌數量大于15億/mL，YEM耦合菌群結構穩定。

通過酶活性測定結果（見表3）表明，YEM組合菌群無論是在藥渣或CMC-Na基質中的纖維素酶全酶活性FPA顯著高于單一菌株的酶活性。常規堆肥TEM菌群在CMC-Na基質中表現出較高的FPA活性，但在以中藥渣為單一基質中的FPA活性較低。YEM組合菌群因添加了對藥渣降解能力較強的菌株，其纖維素全酶活性在藥渣和CMC-Na基質中都表現出明顯增加趨勢，其中在藥渣基質中FPA活性提高64.6%，在CMC-Na基質中也提高25.4%。篩選的抗藥性藥渣降解菌株真菌L2、細菌2#具有良好的共生增效特性，與EM耦合菌群結構穩定，增效明顯，YEM菌群在中藥渣處理中具有廣泛的應用前景。

3 結論

針對中藥渣的抑菌特性，從藥渣高溫腐熟階段篩選出的復合菌系Y-5，在50 ℃靜止培養條件下，在第7天可使濾紙的分解率達到83%，其中對纖維素、半纖維素的分解率分別為75%、78%。利用CMC-Na分離培養基50 ℃培養分離，從Y-5供試樣品中分離到能以CMC-Na作為唯一碳源生長的高溫微生物菌株72株，其中細菌54株、真菌18株;利用剛果紅纖維素篩選培養基進行進一步篩選，得到具有較強纖維素降解能力的菌株8株，其中細菌6株、真菌2株，復選菌株對纖維素的降解率均大于3.0%。通過藥渣基質和CMC-Na基質產酶活性測定，篩選出真菌L2和細菌2#菌株對藥渣和纖維素降解能力都強的抗藥性菌株。通過菌群耦合培養，獲得了結構穩定的YEM耦合菌群，菌種培養5 d活菌數量大于15億/ml，YEM菌劑的纖維素酶活性較Em菌劑提高25.4%～64.6%，尤其是對中藥渣的降解能力提高64.6%，在中藥渣處理中具有廣泛的應用前景。

參考文獻：

[1] Guo FQ， Dong YP， Zhang TH， et al. Experimental study on herb residue gasification in an air-blown circulating fluidized bed gasifier[J]. Ind Eng Chem Res， 2014， 53（34）： 13264-13273.

[2] 何京鐘.中草藥渣堆肥中試及微生物群落研究[D].北京：中國科學院大學，2015.

[3] 焦巧芳.中藥渣微生物轉化利用菌種篩選研究[D].杭州：浙江師范大學，2010.

[4] 郭夏麗，楊小麗，李順義，等.秸稈降解菌的篩選及菌種組合[J].鄭州大學學報（工學版），2010，31（1）：74-77.

[5] 李瑜，王琦，陳五嶺.牛糞堆肥高效降解菌的篩選及復合微生物菌劑的制備[J].安徽農業科學，2008，36（35）：15653-15655.

[6] 胡華.高效纖維素降解菌株的篩選及其復合系菌劑在秸稈堆肥中的應用[D].四川農業大學，2008.

[7] 王元明.高溫纖維素降解菌的篩選及其復合菌劑對秸稈降解效果的研究[D].南京農業大學，2013.

[8] 史龍翔.纖維素降解菌的篩選及其在果樹枝條腐解中的應用[D].西北農林科技大學，2015.

[9] 曾飛，張森，錢大瑋，等.甘草藥渣降解菌的篩選及其產酶工藝研究[J].生物技術通報，2017，33（12）：125-131.

[10] 封曄.高產纖維素酶菌株的篩選及藥渣發酵工藝研究[J].食品安全導刊，2015（33）：140-141.

[11] 張英，鄭清煉，周裕權，等.融合菌株轉化黃芪藥渣生產乙醇的工藝[J].中成藥，2016，38（6）：1421-1424.

[12] 龍良鯤，寒子純，林群英，等.黃芪藥渣中多糖的酶法制備及其抗氧化活性[J].江蘇農業科學，2018，46（1）：137-140.

[13] 郭建軍，范漢東，黃曉萍，等.藥渣纖維素降解菌的篩選及酶活測定[J].湖北農業科學，2012，51（4）：689-692.

[14] 張楠，楊興明，徐陽春，等.高溫纖維素降解菌的篩選和酶活性測定及鑒定[J].南京農業大學學報，2010，33（3）：82-87.