貴州小白及內(nèi)生真菌對塊莖腐爛病拮抗作用研究

曾茜 陳旭 劉璞玉 楊仁德 朱森林 杜慕云

摘 要 植物內(nèi)生真菌作為獲取生物防治材料的一個(gè)潛在且龐大的優(yōu)質(zhì)資源庫，極具開發(fā)應(yīng)用潛力。采用平板對峙法，對已有的137株小白及內(nèi)生真菌進(jìn)行塊莖腐爛病菌菌絲生長的拮抗活性篩選，并以6種常見農(nóng)業(yè)病原菌作為靶標(biāo)菌完成抗菌譜測定，初步獲得抗病能力較強(qiáng)的2株內(nèi)生真菌：菌株GZFJ021和GZLG033。

關(guān)鍵詞 小白及；內(nèi)生真菌；塊莖腐爛病；拮抗作用

中圖分類號(hào)：Q939.96 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.1.002

白及又名箬蘭、連及草和甘根等，隸屬于單子葉植物綱蘭科白及屬，為多年生草本植物。以干燥塊莖入藥，形狀不規(guī)則，多有數(shù)個(gè)爪狀分枝，質(zhì)地堅(jiān)硬，柔韌性好。其性微寒，味苦，歸肺、胃、肝經(jīng)，具有收斂止血、消腫生肌的作用，常用于治療咯血、外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂等病癥[1]。白及作為貴州省珍貴的中藥材品種之一，不僅具有獨(dú)特的藥用和觀賞價(jià)值，還被廣泛應(yīng)用于食品、化工等領(lǐng)域，可開發(fā)利用的潛力巨大[2-3]。據(jù)報(bào)道，目前共發(fā)現(xiàn)4種白及屬植物分布在我國境內(nèi)，其中貴州有3種（白及、黃花白及和小白及），以小白及野生資源較為珍稀[4]。

近年來，隨著白及人工種植規(guī)模擴(kuò)大和連續(xù)種植，加上生態(tài)環(huán)境變化等因素的影響，導(dǎo)致病蟲害頻頻發(fā)生，尤其在高溫高濕條件下，白及易受病原微生物的侵染而出現(xiàn)根腐病、葉褐斑病、灰霉病等[5]。白及作為貴州省道地藥材，市場需求量巨大，但由于病蟲害的影響，特別是塊莖腐爛病危害最為嚴(yán)重，使得產(chǎn)量和品質(zhì)有所下降，制約了白及產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。長期的栽培實(shí)踐表明，農(nóng)藥防治白及塊莖腐爛病效果不理想，并且對環(huán)境和產(chǎn)品質(zhì)量安全均存在較大影響。筆者以前期分離獲得的137株小白及內(nèi)生真菌作為供試菌株，塊莖腐爛病病原菌立枯絲核菌QX1、尖孢鐮刀菌ZF1和ZF2作為靶標(biāo)菌，通過平板對峙法篩選抗病活性菌株，旨在為探索高效的生物防治技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

1）供試目標(biāo)菌：已分離獲得的137株小白及植物內(nèi)生真菌。

2）供試病原菌：白及塊莖腐爛病病原菌立枯絲核菌（Rhizoctonia solani，QX1）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum，ZF1、ZF2）。

供試目標(biāo)菌、供試病原菌均保存于貴陽中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要培養(yǎng)基和儀器

1）培養(yǎng)基：為PDA培養(yǎng)基，使用馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g，加水至1 000 mL，pH值自然。

2）儀器：超凈工作臺(tái)、恒溫生化培養(yǎng)箱等。

1.3 試驗(yàn)方法

1）病原拮抗菌篩選：采用平板對峙法對已有的內(nèi)生真菌進(jìn)行拮抗菌篩選試驗(yàn)。在無菌條件下利用打孔器取直徑7 mm供試病原菌菌餅接種于PDA平板中央，置于26 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，于左右兩邊距離菌落邊緣2 cm處接入內(nèi)生真菌菌餅，無菌面朝上；同樣在上下兩面接入無菌PDA培養(yǎng)基餅作為空白對照，繼續(xù)恒溫培養(yǎng)3～5 d后測量抑菌帶大小。設(shè)3次重復(fù)，取平均值。

2）拮抗菌抗菌譜測定：同樣采用平板對峙法，利用試驗(yàn)1）中獲得的拮抗菌作為目標(biāo)菌，選擇常見的6種作物病原菌進(jìn)行抗菌譜測定，分別為番茄早疫病菌F588、番茄黑斑病菌F788、水稻紋枯病菌WB、小麥赤霉病菌CM、水稻稻瘟病菌DWB和煙草黑脛病菌HJB。試驗(yàn)方法同上。

3）數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析：采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原拮抗菌篩選

采用平板對峙法對137株小白及內(nèi)生真菌抗病活性進(jìn)行初篩。結(jié)果共篩選出5株內(nèi)生真菌，菌株GZYS007、GZFJ021、GZFJ028、GZLG033、GZLG25對白及塊莖腐爛病病原菌立枯絲核菌QX1、尖孢鐮刀菌ZF1和ZF2的菌絲生長表現(xiàn)出較強(qiáng)抑制活性（見表1）。其中，對立枯絲核菌QX1產(chǎn)生的抑菌帶從大到小依次為：GZYS007（11.50）>GZFJ021（10.75）>GZLG033（9.75）>GZLG25（8.50）>GZFJ028（4.50）；對尖孢鐮刀菌ZF1，ZF2則分別為：GZFJ021（13.00）>GZLG033（11.00）>GZFJ028（6.75），GZFJ021（11.25）>GZLG033（10.25）>GZFJ028（9.50）>GZLG25（3.75）。綜合分析認(rèn)為，菌株GZFJ021、GZLG033和GZFJ028的抑制效果最好，可作為下一步抗菌譜篩選試驗(yàn)的目標(biāo)菌株。

2.2 拮抗菌抗菌譜測定

采用相同方法對3株活性較好的白及塊莖腐爛病拮抗菌進(jìn)行抗菌譜測定試驗(yàn)，結(jié)果顯示，3株內(nèi)生真菌GZFJ021、GZFJ028、GZLG033對常見農(nóng)業(yè)病原菌小麥赤霉病菌、水稻紋枯病菌、馬鈴薯晚疫病菌、煙草黑脛病菌、玉米灰斑病菌和高粱炭疽病菌能產(chǎn)生較強(qiáng)的生長抑制效果（見表2）。其中，菌株GZFJ021對6種病原菌均具有一定抑制活性，從大到小依次為：煙草黑脛病菌（14.50）>小麥赤霉病菌（14.00）>水稻紋枯病菌（12.75）>高粱炭疽病菌（10.25）>馬鈴薯晚疫病菌（6.25）>玉米灰斑病菌（5.50）；菌株GZLG033次之，對水稻紋枯病菌和玉米灰斑病菌抑制效果較強(qiáng)，分別為14.25和12.75；菌株GZFJ028相對較差，能對煙草黑脛病菌菌絲生長產(chǎn)生大小為11.25的抑菌帶。因此，內(nèi)生真菌GZFJ021和GZLG033表現(xiàn)出較廣的抗菌譜，且活性也較強(qiáng)，可作為生防菌資源儲(chǔ)備。

3 討論與展望

植物內(nèi)生真菌一般是指那些部分或整個(gè)生活史存在于健康植物組織和器官中，而不會(huì)對宿主產(chǎn)生侵染現(xiàn)象或明顯病害癥狀的一類真菌。它們能通過調(diào)控植物生理代謝來增強(qiáng)寄主在環(huán)境中的抗逆性、適應(yīng)性等[6]。植物內(nèi)生真菌豐富的生物多樣性造就了次生代謝產(chǎn)物的多樣性，其效用活性涵蓋了醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)及工業(yè)生產(chǎn)等多個(gè)領(lǐng)域。特別是生長于生態(tài)系統(tǒng)復(fù)雜多樣環(huán)境中的植物，其內(nèi)生真菌產(chǎn)生活性物質(zhì)的可能性更大，且效用更強(qiáng)[7]。

生物防治作為化學(xué)藥劑理想的替代方法，具有安全、生態(tài)、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢，主要是利用有益或功能性生物及其代謝產(chǎn)物來控制有害生物種群的發(fā)生，減少危害。本研究初步篩選出2株具有白及塊莖腐爛病拮抗活性的內(nèi)生真菌，表現(xiàn)為抗菌譜廣、效用強(qiáng)，可為中藥材人工種植病害生防技術(shù)的開發(fā)提供材料基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[2] 徐中志，譚敬菊，陳翠，等.不同白及種源分析評(píng)價(jià)與利用研究[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，23（1）：90-92.

[3] 何海玲，顧龔平，張衛(wèi)明.白及多糖膠涂膜保鮮櫻桃番茄的研究[J].食品科學(xué)，2007，28（4）：336-340.

[4] 和志嬌，呂麗芬，楊麗云，等.白及種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，21（4）：1081-1085.

[5] 曾令祥，楊琳，陳婭婭，等.貴州中藥材白及病蟲害種類的調(diào)查與綜合防治[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（7）：106-108.

[6] Tetard C， Edwards R， Catherine TJ， et al. Potential roles for microbial endophytes in herbicide tolerance in plants[J]. Pest Manag Sci， 2016， 72（2）： 203-209.

[7] 陳旭，曾茜，劉璞玉，等.貴州小白及內(nèi)生真菌多樣性與產(chǎn)抗病活性物質(zhì)菌株的篩選[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，30（1）：111-117.

（責(zé)任編輯：丁志祥）