超高效液相色譜—質譜串聯優化方法檢測小麥脫氧麥根酸

樊慶琦 崔德周 郭鋼

摘要 [目的]采用超高效液相色譜-質譜串聯優化方法檢測小麥脫氧麥根酸（DMA）。[方法]以山東省5個小麥品種為研究對象，利用超高效液相色譜-質譜聯用（UPLC/ESI-MS）檢測小麥苗期根系洗脫液的DMA。[結果]一級質譜分子離子峰m/z 305.2，二級質譜以正離子m/z 286.8和m/z 133.9進行定量，DMA標準品與小麥根系洗脫液的質譜圖完全一致，因此，該方法可適用于大批量檢測普通小麥根系洗脫液DMA。5個小麥品種在正常培養下，DMA分泌速率較低，但在缺鐵脅迫下，DMA分泌速率呈極顯著升高，增加6 242.86～62 833.42倍。[結論]小麥脫氧麥根酸UPLC/ESI-MS檢測方法的建立，為深入研究其遺傳機理提供了方法基礎。

關鍵詞 小麥；脫氧麥根酸；超高效液相色譜-質譜聯用

中圖分類號 S512.1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）20-0155-04

Abstract [Objective] The research aimed to detect wheat deoxyger minic acid（DMA） by ultrahigh performance liquid chromatographytandem mass spectrometry （UPLCMS/MS） serial optimization method.[Method]Five wheat varieties from Shandong Province were selected to study the DMA of root eluent in wheat seedling stage by UPLC/ESIMS.[Result] The first class mass spectrometry ion peak was m/z 305.2 and the second class mass spectrometry was quantified by positive ions m/z 286.8 and m/z 133.9. The standard product was identical with mass spectrum of wheat root eluent. Therefore， this method could be applied to mass detection of DMA in root eluent of common wheat. The DMA secretion rate of the five varieties was low under control treatment， but increased significantly under iron deficiency， which increased by 6 242.86-62 833.42 times. [Conclusion]The establishment of UPLC/ESIMS method for DMA detection in wheat provides a basis for the further study of its genetic mechanism.

Key words Wheat；Deoxygerminic acid（DMA）；UPLC/ESIMS

包括小麥在內的禾本科單子葉植物，根系能夠合成麥根酸類物質（即植物鐵載體，簡稱PS）并分泌至根系周圍，螯合游離態的Fe3+，并經根系轉運至體內滿足生長發育必需的鐵營養[1-2]。目前已明確，麥根酸類物質具有多種形式，L-甲硫氨酸作為合成前體，與ATP一起形成S-腺苷甲硫氨酸（SAM），3個分子的S-腺苷甲硫氨酸在尼克煙酰胺合成酶（NAs）催化下合成1個分子的尼克煙酰胺（NA），尼克煙酰胺在煙酰胺氨基轉移酶（NAAT）等酶的催化作用下，形成脫氧麥根酸（DMA），進一步轉化為麥根酸（MA）、阿凡酸（AVA）、羥基麥根酸（HMA）、3-表羥基麥根酸（epi-HMA）、3-表羥基脫氧麥根酸（epi-HDMA）等麥根酸類植物鐵載體[3]。普通小麥主要以DMA為主[4-6]。

對于麥根酸類物質的定量檢測，眾多學者開展了大量的研究，提出了不同的檢測方法。一類是根據麥根酸類物質與鐵螯合的特性，通過比色法間接測量鐵的活化量，經換算后得出PS的分泌率[7]；另一類是通過紙層析法[1，8-9]和高效液相色譜熒光方法等[10-13]。根據離子交換的原理，高效液相色譜檢測又可分為陽離子交換[10-11]、離子對[12]和陰離子交換[13]等不同方法。高效液相色譜檢測作為廣泛采用的方法，需要對樣品進行純化濃縮等前處理，有時還需要柱后衍生等步驟，而且流動相較為復雜，單個樣品的分析時間也較長，因此，并不適合進行大批量麥根酸類物質的檢測。

近年來，有學者以水稻為研究對象，發展了利用超高效液相色譜-質譜對麥根酸類物質進行定量檢測[14-15]，該方法具有靈敏度高、無需濃縮純化等前處理步驟，具有高效、精確、快速的特點，可進行樣品的高通量檢測。筆者以普通小麥為研究對象，探索利用超高效液相色譜-質譜串聯方法批量檢測小麥苗期DMA分泌率，旨在為小麥麥根酸分泌的遺傳規律和生理機制奠定方法基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

小麥材料為山東省審定小麥品種濟麥22、煙農19、良星99、泰農18和山農22。脫氧麥根酸（DMA）標準品由加拿大TRC公司生產。

1.2 小麥苗期缺鐵脅迫的營養液培養

挑選每份材料籽粒飽滿的種子30粒，3次重復。種子經1.5%次氯酸鈉消毒5 min 后，腹股溝朝下，均勻擺放至珍珠棉和紗網縫制的發芽盤，然后將其放入盛有1 L超純水的培養盒（15 mm×15 mm×20 mm）中，在人工智能溫室中發芽，光照16 h/8 h，光強12 000 lx，溫度25 ℃，3 d換水1次。

種子發芽7 d后，仔細將種子從幼苗根部去除，加入培養液進行培養。其中，對照處理營養液配方為0.7 mmol/L K2SO4、0.1 mmol/L KCl、2 mmol/L Ca（NO3）2、0.5 mmol/L MgSO4、0.1 mmol/L KH2PO4、1 μmol/L H3BO4、0.5 μmol/L MnSO4、0.2 μmol/L CuSO4、0.5 μmol/L ZnSO4、0.01 μmol/L（NH4）6Mo7O24、100 μmol/L FeEDTA。缺鐵脅迫營養液配方除無FeEDTA外，其余如對照處理。營養液3 d換1次，幼苗培養15 d后，進行麥根酸分泌的搜集。

幼苗在營養液中培養15 d后，挑選長相均勻粗壯的幼苗20株，超純水沖洗3次，08：00將其放入盛有500 mL超純水的燒杯中，進行麥根酸的搜集，搜集光強12 000 lx。搜集3 h后，將搜集液加入滅菌片處理5 min后，抽取50 mL存放至-40 ℃冰箱中作為待測液。根系則完整取下，烘干稱重。

1.3 分泌的麥根酸質譜檢測

1.3.1 藥品和試劑。氨水（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；甲酸[色譜純，阿沙埃莎（天津）化學有限公司]；甲醇、乙腈（色譜純，美國飛世爾科技公司）。

1.3.2 儀器設備。

超高效液相色譜系統（LC-30A，日本島津公司）；三重四級桿串聯質譜儀（TripleQuad 4500），配帶電噴霧離子源（ESI）及Analyst工作站，美國AB SCIEX公司；氮吹儀（JNC N-EVAPTM112型，美國Organomation 公司）；漩渦混合器（MS 3 型，德國IKA公司）；Milli-Q超純水系統（Advantage A10型，美國Millipore 公司）；電子天平（BSA224S-CW，賽多利斯公司）；固相萃取裝置（24位，美國Supelco公司）；Cleanert PCX 60 mg/3 mL Cartridge固相萃取小柱（天津博納艾杰爾科技有限公司）；Thermo Scientific Hypersil GOLD柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm，美國飛世爾科技公司）。

1.3.3 色譜與質譜條件。

色譜柱：Hypersil Gold 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；柱溫40 ℃，樣品室溫度4 ℃；進樣體積5.0 μL；流動相A為0.2 % 甲酸-水，流動相B為乙腈；流速為0.4 mL/min，梯度洗脫。

離子源：電噴霧離子源（ESI），正離子模式；掃描方式：多反應監測掃描（MRM）；霧化氣（TEM）溫度：600 ℃；霧化氣壓力（GS1）：60 psi；輔助加熱氣壓力（GS2）：55 psi；氣簾氣壓力（CUR）：25 psi；噴霧電壓（IS）：5 500 V；碰撞氣體（CAD）：7 psi；駐留時間100 ms。

式中，X為樣品中待測物殘留量（μg/kg）；m為樣品質量（g）；V為試樣最終定容體積（mL）；C為根據標準工作曲線算出進樣液的濃度（μg/L）。

1.3.5 樣品處理。取5.0 mL缺鐵營養液培養根系洗脫待測液稀釋1倍，用甲酸調pH為2.5～3.0，以備UPLC/ESI-MS測定。

取20.0 mL正常營養液培養根系洗脫液，用甲酸調 pH為2.5～3.0，待提純濃縮。步驟如下：PCX固相萃取柱依次使用3 mL 甲醇預洗活化，3 mL水平衡，加入酸化后的樣品溶液，然后用3 mL水、3 mL甲醇依次淋洗固相萃取柱，棄去淋洗液，用6 mL 2%氨化甲醇洗脫，收集洗脫液，40 ℃水浴下，氮氣吹至近干，超純水定容至1 mL，渦旋振蕩，過0.22 μm微孔濾膜，以備UPLC/ESI-MS測定。

2 結果與分析

2.1 DMA分析方法的優化

2.1.1 固相萃取柱的選擇。試驗對C18固相萃取柱和PCX固相萃取柱的回收率進行了比較，前者的回收率低于10%，而后者的回收率在70%以上，這是因為麥根酸含有仲胺基，帶正電荷，易與陽離子交換柱的磺酸基產生靜電吸引作用而被吸附，最后通過堿性洗脫液中和叔胺基，降低離子交換作用而被洗脫出來。同時還發現，提取液的酸化對回收率影響較大，固相萃取柱上樣前，應調節樣品溶液pH為2.5～3.0。

2.1.2 質譜條件的優化。

麥根酸的化學結構如圖1所示，它含有3個羧基，在水溶液中表現出弱酸性，易電離成負離子化合物，同時，它也含有叔胺基團。因此，麥根酸在酸性條件下呈現正電荷，在堿性條件下呈現負電荷。研究發現，在ESI-和ESI+模式下，后者的響應值明顯高于前者。在ESI+模式下，樣品具有離子化效率高、信號強的特點。因此，該試驗采用正離子模式。

麥根酸的一級質譜和二級質譜如圖2～3所示。一級質譜圖中，分子離子峰為m/z 305.2。二級質譜麥根酸片段離子主要是兩正離子m/z 133.9和m/z 286.8，因此，以這2個正離子作為定量分析的離子。標準品與小麥根系洗脫液的一級質譜和二級質譜完全相同，表明小麥根系洗脫液中的分泌物確為DMA。

2.2 標準曲線

配制5～200 μg/L系列標準溶液，以進樣濃度（μg/L）為橫坐標、定量離子對的色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，獲得的相關線性方程Y=2 001.3X-18.4，相關系數r=0.999 9。標準色譜圖見圖4。

2.3 方法的靈敏度、準確度和精密度

對空白水樣品在10、50、200 μg/kg 3個濃度水平上進行添加，每個平行重復5次，進行提取凈化，校正曲線定量。添加量、平均回收率和精密度見表1。結果表明，在添加量為10～200 μg/kg，平均回收率為77.2%～83.2%，相對標準偏差（RSD）為5.9%～15.0%。

2.4 麥根酸化學性質的穩定性

常溫下，麥根酸化學性質不穩定，容易分解。因此，以標準品50、125和250 μg/L這3個濃度水平，在樣品室4 ℃條件下，考察在0、3、6和10 h的濃度變化。結果表明（表2），在不同濃度梯度條件下，試驗10 h后，每個濃度梯度均表現較好的化學穩定性，其變異系數在0.89%～1.87%。因此，麥根酸在4 ℃條件下，可保持較好的化學穩定性。

2.5 普通小麥DMA分泌速率

5個小麥品種在正常營養液和缺鐵營養液培養，根據定量離子，經公式計算根系洗脫液DMA的含量，結果見表3。在正常營養液培養條件下，DMA分泌速率較低，為0.008 11～0.081 50 μg/（g·株·h）；但在缺鐵脅迫條件下，DMA分泌速率為50.80～5 121.14 μg/（g·株·h），增加倍數在6 242.86～62 833.42。就增加倍數而言，5個小麥品種從大到小依次為山農22、良星99、泰農18、煙農19、濟麥22，表明在缺鐵脅迫下，山東省當前大面積推廣品種均可以顯著誘導DMA的大量分泌，以應對缺鐵脅迫逆境。

3 討論與結論

隨著檢測技術的發展，通過液相色譜-質譜聯用進行單子葉禾本科作物的DMA測定，具有靈敏度高、簡單快速、重復性好等特點[14-15]，特別適用于進行高通量DMA檢測。所不同的是，Kakei等[14]首先利用衍生劑芴甲氧羰酰氯（Fmoc-Cl）與DMA螯合進行柱前衍生，pH調至8.0時信號最強，m/z為752。李金輝等[15]利用HPLC-MS/MS進行尼克酰胺（NA）的分析，NA與DMA化學式相比，前者比后者多1個氨基，而少2個羥基。一級質譜顯示分子離子峰為m/z 304.43，而該研究的分子離子峰為m/z 305.2，結果基本一致，推測可能是由于不同儀器的誤差所導致；二級質譜正離子峰m/z 286.52和m/z 185.17，該研究結果則為m/z 286.8和m/z 133.9，推測作為定量的2個正離子，1個可能完全相同，另1個離子則不相同，可能的原因是NA和DMA化學結構并不完全相同。總的來說，該研究的測定結果與李金輝等[15]的測定結果趨勢一致。因此，可用液相色譜-質譜聯用方法進行大批量小麥麥根酸類物質的分析測定。

在對根系洗脫液DMA進行濃縮純化時，試驗表明，隨著添加量的增加，回收率呈增加趨勢，說明在正常營養液培養的條件下，小麥品種普通存在DMA分泌量較低的現象，進行濃縮純化可以提高試驗精度。在缺鐵脅迫的條件下，由于小麥植株感知缺鐵信號，在體內大量合成分泌DMA，利用該方法，應稀釋1～5倍后再進行試驗，可取得良好的效果。

普通小麥根系DMA的合成與分泌，對植株生長發育所需的鐵營養具有重要意義。目前，已在普通小麥中分離了編碼314個氨基酸的DMA合成基因（TaDMAS1）[5]，該基因不但在根系中表達，還在芽細胞中表達。Bonneau等[16]還鑒定了21個小麥NA合成基因，明確了這些基因在種子萌芽期、苗期和生殖生長期進行表達。通過小麥DMA分泌方法的建立，有助于開展小麥DMA合成、分泌和信號傳導等方面的研究。

參考文獻

[1] TAKAGI S I.Naturally occurring ironchelating compounds in oatand riceroot washings[J].Soil science & plant nutrition，1976，22（4）：423-433.

[2] RMHELD V，MLLER C，MARSCHNER H.Localization and capacity of proton pumps in roots of intact sunflower plants[J].Plant physiology，1984，76（3）： 603-606.

[3] KOBAYASHI T，NAKANISHI H，NISHIZAWA N K.Recent insights into iron homeostasis and their application in gra minaceous crops[J].Proceedings of the Japan academy，2010，86（9）：900-913.

[4] MORI S.Iron acquisition by plants[J].Current opinion plant biology，1999，2（3）： 250-253.

[5] KOBAYASHI T，NISHIZAWA N K，MORI S.Molecular analysis of irondeficient Gra minaceous plants[M]// BARTON L L，ABADIA J.Iron nutrition in plants and rhizospheric microorganisms.Netherlands：Springer Verlag，2006： 395-435.

[6] UENO D，ROMBOL A D，IWASHITA T，et al.Identification of two novel phytosiderophores secreted by perennial grasses[J].New phytologist，2007，174（2）： 304-310.

[7] 于福同，張愛民，張福鎖.小麥植物鐵載體分泌基因的染色體定位[J].遺傳學報：英文版， 1999（5）：552-557.

[8] KAWAI S，TAKAGI S，SATO Y. Mugineic acidfamily phytosiderophores in rootsecretions of barley， corn， and sorghum varieties[J].Plant nutrition，1988，11：633-642.

[9] TAKAGI S.Production of phytosiderophores[M]//BARTON L L，HEM MIN B C.Iron chelation in plants and soil microorganisms.New York：Academic Press，1993：111-131.

[10] KAWAI S，SATO Y，TAKAGI S，et al.Separation and deter mination of mugineic acid and its analogues by highperformance liquid chromatography[J].Journal of chromatography，1987， 391（1）：325-327.

[11] MORI S，NISHIZAWA N，KAWAI S，et al.Dynamic state of mugineic acid and analogous phytosiderophores in Fedeficient barley[J].J Plant Nutrition，1987，10：1003-1011.

[12] HIRADATE S，INOUE K.Deter mination of mugineic acid， 2deoxymugineic acid， 3hydroxymugineic acid， and their iron complexes by ionpair HPLC and colorimetric procedures[J]. Soil Sci Plant Nutrition，1996，42（3）：659-665.

[13] NEUMANN G，HAAKE C，RMHELD V.Improved HPLC method for deter mination of phytosiderophores in root washings and tissue extracts[J].Journal of plant nutrition，1999，22（9）：1389-1402.

[14] KAKEI Y，YAMAGUCHI I，KOBAYASHI T，et al.A highly sensitive， quick and simple quantification method for nicotiana mine and 2′deoxymugineic acid from minimum samples using LC/ESITOFMS achieves functional analysis of these components in plants[J].Plant & cell physiology， 2009，50（11）：1988-1993.

[15] 李金輝，蔣欣杭，吳世華.水稻尼克酰胺鐵載體的高效液相色譜—電噴霧質譜分析[J].浙江農業學報，2013，25（1）：8-13.

[16] BONNEAU J，BAUMANN U，BEASLEY J，et al.Identification and molecular characterization of the nicotiana mine synthase gene family in bread wheat[J].Plant biotechnology journal，2016，14（12）：2228-2239.