斯魯菲亞海洋紅酵母培養基優化

張川　徐志進　柳敏海

摘要[目的]比較不同的碳源、氮源、無機鹽對斯魯菲亞海洋紅酵母（Rhodotorula slooffiae）菌株產量的影響，確定培養基最優組分。[方法]通過葡萄糖、酵母浸粉、硫酸銨、磷酸二氫鉀4因素3水平的正交試驗，確定斯魯菲亞海洋紅酵母的最優培養基。[結果]斯魯菲亞海洋紅酵母的最優培養基各成分質量分數為：葡萄糖2%，酵母浸粉0.75%，硫酸銨0.5%，磷酸二氫鉀1%。接種量6%，500 mL三角錐形瓶，裝液量100 mL，培養溫度30 ℃，經過48 h培養，菌種量最大可達8.6×108 CFU/mL，比優化前的發酵培養基產量（6.6×108 CFU/mL）提升了30%。[結論]培養條件和工藝的優化可以顯著提高海洋紅酵母菌量和類胡蘿卜素含量。

關鍵詞海洋紅酵母；發酵；培養條件優化

中圖分類號S917.1文獻標識碼A文章編號0517-6611（2018）28-0001-03

Fermentation Conditions Optimization of Rhodotorula slooffiae

ZHANG Chuan，XU Zhijin，LIU Minhai et al

（Zhoushan Fisheries Research Institute of Zhejiang Province， Zhoushan，Zhejiang 316000）

Abstract[Objective]The effects of different carbon sources， nitrogen sources and inorganic salts on fermentation yield of marine red yeast（Rhodotorula slooffiae） were compared to determine the optimal medium components. [Method]The optimum fermentation conditions for Rhodotorula slooffiae were determined by 4 factors and 3 levels orthogonal test.[Result]The optimum fermentation conditions for Rhodotorula slooffiae were determined： glucose 2%， yeast extract powder 0.75%， ammonium sulfate 0.5%， monopotassium phosphate 1%， and inoculation amount 6%， temperature 30 ℃， 100 mL medium in 500 mL triangle bottle and fermentation time 48 h. Under above conditions， the cell biomass of marine red yeast can reach 8.6×108 cfu/mL， which increased by 30% as compared with the fermentation before optimization. [Conclusion]Optimization of culture conditions and process can significantly increase the amount of marine red yeast and carotenoid content.

Key wordsMarine red yeast；Fermentation；Conditions optimization

海洋紅酵母（Rhodotorula slooffiae）是存在于海水中的一種單細胞酵母品系，大部分分布在海水和海底沉積物中，通過合成各種酶和代謝產物，可以在極端環境下生存；也有一些種類寄附在魚蝦和貝類上，互利共生[1-2]。海洋紅酵母富含豐富的蛋白質、必需氨基酸、天然色素、維生素等生物活性物質，具有較高的營養價值，此外還可以使水產動物色澤亮麗，肉質鮮美，常被作為水產動物育苗的開口餌料[3-4]。海洋紅酵母中含有的葡聚糖和甘露糖蛋白等成分，使其能刺激宿主的免疫和抗氧化系統，提高抗氧化、生物免疫力和抗基因毒性等功能[5]。養殖飼料中添加海洋紅酵母可以有效提高水產動物幼苗的存活率和抗病能力，還可以提高蝦青素在動物體內的積累，增強動物免疫力和惡劣環境耐受力[6]。

在生態環境修復方面，海洋紅酵母可以將烴類化合物降解為小分子物質，吸收重金屬離子，處理海洋污染。水體酸化方面應用廣泛。海洋紅酵母能夠促進腸道中益生菌的生長繁殖，起到調整腸胃的發酵過程以及pH，有助于腸胃平時的消化吸收活動，其作為食品添加劑已經被廣泛應用于食品加工中[7]。

近年來，關于海洋紅酵母的研究逐漸增加，主要集中在菌種的選育、代謝產物的測定、發酵工藝優化和促進類胡蘿卜素合成等方面。優化海洋紅酵母的發酵工藝具有重要的生態價值和經濟價值。該研究從選擇最佳碳源、氮源和無機鹽及最適質量分數入手，優化斯魯菲亞海洋紅酵母培養基，提高產率降低成本，旨在為該菌株的下一步工業化發酵罐生產提供理論依據和參考。

1材料與方法

1.1菌種

1.1.1菌種來源。

海洋紅酵母，由遼東學院提供，菌株培養采用YPD培養基。

1.1.2培養基。

YPD培養基：葡萄糖2.0%，蛋白胨1.0%，酵母浸粉0.5%，瓊脂2.0%，陳海水100 mL，自然pH。種子培養基：葡萄糖1.0%，硫酸銨1.0%，酵母浸粉1%，磷酸二氫鉀1%，陳海水100 mL，自然pH。

1.1.3菌株培養 。

斜面活化。保存于冰箱中的菌種接種到斜面培養基上活化，30 ℃培養48 h。

1.1.4搖床擴陪。從斜面培養基上接種到500 mL三角錐形瓶中，裝液量為80 mL，30 ℃，160 r/min，培養24 h形成種子培養基。再將種子培養基以6%的接種量，接入裝量100 mL的500 mL 錐形瓶發酵培養基中，搖床轉速設為180 r/min。

1.1.5酵母菌的生理生化鑒定。

參照《微生物學實驗手冊》[8]和《酵母菌的特征與鑒定手冊》[9]對海洋紅酵母進行糖源發酵、碳源同化、氮源同化等生理生化試驗。

1.2培養基發酵條件優化試驗

1.2.1單因素試驗。

以種子培養基為基準培養基，調節各培養基要素，其中，

碳源試驗：以葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉為碳源，含量為同一質量分數（1%～2%），培養條件：溫度30 ℃、鹽度28.5‰、pH 8.2；培養容器為三角錐形瓶；培養時間為48 h。

氮源試驗：分別以硫酸銨、氯化銨、蛋白胨、酵母浸粉為氮源，含量設置為同一質量分數1%；培養條件：溫度30 ℃、鹽度28.5‰、pH 8.2；培養容器：三角錐形瓶；培養時間4 8 h。

無機鹽試驗：以磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣為其他無機成分，含量為同一質量分數（1%～2%），培養條件：溫度30 ℃、鹽度28.5‰、pH 8.2；培養容器：三角錐形瓶；培養時間48 h。

以海洋紅酵母生物量為參考指標，挑選適宜的碳源、氮源和無機鹽以及培養基用量。

1.2.2正交試驗。

根據單因素試驗結果，選擇葡萄糖、酵母浸粉、硫酸銨、磷酸二氫鉀4個因素，各取3個水平（表1），共設有9個組，每組有3個平行對照，取各數據平均值，篩選出最優組合。

1.3細胞生物量測定

采用血球板計數法，將取出的發酵液稀釋100倍，用膠頭滴管吸取后滴到血球計數板上，用蓋玻片蓋好，放于顯微鏡40倍鏡下觀察并找到網格，換100倍鏡計數[8]。

1.4類胡蘿卜素提取與測定

采用丙酮法萃取得到類胡蘿卜素提取液，使用分光光度計在475 nm處測定吸光度，根據公式計算：色素含量（μg/g干菌體）=Amax×D×V/0.16W，式中，A為475 nm波長處的吸光度，V為丙酮的用量（mL），D為測定試樣時的稀釋倍數，W為酵母菌干重（g），0.16為胡蘿卜素的摩爾消光系數[10]。

2結果與分析

2.1酵母菌生長曲線

發酵培養后，從0 h開始，每隔6 h取樣一次，進行菌數測定，記錄數據，并繪制該菌株生長曲線，如圖1所示。從圖1可以看出，在接種6 h之后，菌體即快速生長，6～36 h菌株進入對數期快速增長，菌的數量達到最高6.6×108 CFU/mL，36 h后菌數下降，之后逐漸進入衰亡期。

2.2單因素試驗結果

2.2.1最佳碳源和質量分數。

用4種不同碳源（葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、淀粉）作比較試驗，其質量分數相同（1%），在其他成分相同的情況下，斯魯菲亞紅酵母對4種碳源都能夠同化，其中對葡萄糖利用效果最好（表2）。以葡萄糖為碳源的培養基中，酵母菌的生物量達到5.6×108 CFU/mL；而使用淀粉作為碳源效果最差，酶母菌的生物量只有3.7×108 CFU/mL。麥芽糖在提高菌體中類胡蘿卜素含量方面效果最好，葡萄糖次之，蔗糖最差。

以葡萄糖作為碳源，選擇不同質量分數的葡萄糖進行試驗，結果如圖2所示。在葡萄糖質量分數為1%～2%時，隨著葡萄糖質量分數的增加，菌量也在增大，當葡萄糖濃度達到2%時菌數最高；當葡萄糖濃度大于2%時，菌數逐漸下降，當葡萄糖濃度為5%時，菌數最低只有4.8×108 CFU/mL。綜上所述，選擇2%葡萄糖作為碳源，海洋紅酵母的產量最高，達到6.2×108 CFU/mL，葡萄糖質量分數過高過低都不利于紅酵母增殖。

2.2.2最佳氮源的確定。

用4種不同的氮源（蛋白胨、硫酸銨、氯化銨、酵母浸粉）作比較試驗，其質量分數相同（1%），在其他成分相同的情況下，發現含有酵母浸粉的培養基對菌體生長更有利，菌數最高可達5.57×108 CFU/mL（表3）。有機氮源對菌生物量的促進作用高于硫酸銨、氯化銨這些無機氮源；但無機氮源更有益于類胡蘿卜素含量的增加[11]。通過無機氮源和有機氮源的科學調配可以實現對海洋紅酵母發酵后期效價單位的漲幅調控和生長周期的延長，所以應該在培養基中選擇一定量的硫酸銨搭配酵母浸粉使用[12]。

2.2.3最佳無機鹽的確定。

用3種無機鹽（磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸鎂）作比較試驗，其質量分數相同（1%），在其他成分相同的情況下，發現含有磷酸二氫鉀的培養基對菌體生長和類胡蘿卜素的合成促進作用更明顯（表4）。

以磷酸二氫鉀為無機鹽，檢驗不同濃度下磷酸二氫鉀對海洋紅酵母生物量的影響，結果如圖3所示。當無機鹽質量分數為0.5%～1.0%，酵母菌生物量隨著鹽濃度升高而增加。無機鹽濃度在1.0%～2.0%時，鹽濃度抑制酵母菌量的增長，在2.0%～2.5%時生物量又略有上升。總體來說，培養基中磷酸二氫鉀的質量分數為1%時，菌數最大為4.72×108 CFU/mL。

2.3正交試驗結果

通過單因素試驗，確定培養基最優組分。使用SPSS軟件對數據進行方差分析和顯著性差異分析。從表5可知，4種因素對斯魯菲亞海洋紅酵母菌株發酵菌量影響各不相同，順序為B>A>D>C。硫酸銨濃度變化對海洋紅酵母菌數影響不顯著（P>0.05），酵母浸粉濃度的變化對海洋紅酵母菌數具有顯著性影響（P<0.05），其最適濃度為0.75%。海洋紅酵母菌數最優培養條件為A2B3C1D2，即葡萄糖2%，酵母浸粉0.75%，硫酸銨0.5%，磷酸二氫鉀1.0%，在此優化條件下海洋紅酵母菌量可達8.6×108 CFU/mL，比優化前的發酵培養基（6.6×108 CFU/mL）提升了30%。

3結論與討論

對斯魯菲亞海洋紅酵母進行培養基優化，對于提高菌的生物量而言葡萄糖效果最好，最佳質量分數為2%；最佳氮源為酵母粉和硫酸銨，最佳質量分數分別為0.75%和0.5%；無機鹽中1.0%磷酸二氫鉀效果最好。在此培養條件下，海洋紅酵母菌量最大可達到8.6×108 CFU/mL，比優化前的發酵培養基（6.6×108 CFU/mL）提升了30%。正交試驗中4種因素對斯魯菲亞海洋紅酵母菌株發酵菌量影響各不相同，其中酵母浸粉>葡萄糖>磷酸二氫鉀>硫酸銨。需要指出的是配比3%葡萄糖、0.75%酵母浸粉、1%硫酸銨、1%磷酸二氫鉀的培養基，紅酵母菌量達到8.4×108 CFU/mL，實際生產過程中可以根據原料來源和成本綜合考量，選擇最優配比。

海洋紅酵母是海洋環境中重要的菌種資源，其所含有的豐富營養物質及代謝過程中產生的活性物質，使其具有廣泛的市場前景和經濟效益。現階段國內外學者對海洋紅酵母的研究大多集中在菌種選育、發酵工藝優化和促進類胡蘿卜素合成等方面的研究。而培養基中不同的pH、溫度、光照和接種量也會影響紅酵母的生物量和類胡蘿卜素的產量[13-14]，添加不同金屬離子和氨基酸對海洋紅酵母發酵生產蝦青素具有重要的影響[3]。綜上研究可見，不同的培養條件和工藝對海洋紅酵母的生長和色素的合成有很大的影響，所以進一步研究優化海洋紅酵母的培養條件，能為海洋紅酵母的開發應用提供重要的理論基礎和實踐意義[15]。

參考文獻

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[2] 李臣，阮榕生，林向陽，等.紅酵母的性質及其應用研究[J].農產品加工，2006（5）：20-22，25.

[3] 劉秀蓮，王宇光.海洋紅酵母的研究進展[J].生物技術通訊，2008，19（2）：293-295.

[4] 趙昌會，羅靜瑤.海洋酵母菌的研究進展[J].湖南科技學院學報，2008，29（8）：59-60.

[5] 張超，劉軍.SCP生產菌海洋紅酵母搖瓶培養研究[J].四川輕化工學院學報，2010，13（3）：71-74.