土壤中產高活性淀粉酶細菌的分離與純化

文狄 褚丹維 羅紹嬌 丁淑金 蒙幫明

摘要 [目的]從土壤中分離純化產高活性淀粉酶細菌，并研究其產酶條件。[方法]利用淀粉水解圈平板篩選法，從都勻市23份不同地點的土樣中分離并篩選到一株產胞外淀粉酶的菌株Z3，其水解圈/菌落直徑比達5.50；通過形態學、染色等方法，結合16S rDNA序列的比對鑒定該菌株為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）。并對Z3菌株產酶條件進行了研究。[結果]Z3菌株在1.0%淀粉的碳源、1.0%酵母膏+1.0%牛肉膏的氮源、0.2%的CaCl2·2H2O、30 mL裝液量于250 mL搖瓶中的溶氧量，pH為7.0，培養溫度為37 ℃的條件下，產酶能力最強。此外，Z3菌株所產淀粉酶的酶學分析顯示，其最適酶反應pH為8.0，最適反應溫度為39 ℃。[結論]該菌株是產淀粉酶較好的材料，具有一定的應用前景。

關鍵詞 淀粉酶；水解圈；酶活力；產酶條件

中圖分類號 S154.3 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）27-0006-04

Isolation and Purification of Bacteria Producing Highly Active Amylase in Soil

WEN Di，CHU Danwei，LUO Shaojiao et al

（College of Biological Science and Agriculture， Qiannan Normal University for Nationalities， Duyun， Guizhou 558000）

Abstract [Objective]Bacteria producing highly active amylase in soil was isolated and purificated，and enzyme production conditions were studied.[Method]Using starch hydrolysis circle model， a amylaseproducing strain Z3 was screened from 23 soil samples in Duyun. The hydrolysis circle/colony diameter ratio were 5.50； Z3 was identified as Bacillus cereus strain by the morphological observation， staining and 16S rDNA sequences alignment analysis. [Result]The optimum carbon source， nitrogen source， concentration of CaCl2·2H2O， dissolved oxygen， pH and temperature was 1% starch， 1% yeast extract+1% beef extract， 0.2% CaCl2·2H2O， adding 30 mL medium into 250 mL flask， pH 7.0 and 37 ℃respectively. Besides， the enzymatic analysis of Z3 amylase showed that its optimum pH and temperature was 80 and 39 ℃ respectively. [Conclusion]This study showed that Z3 strain was a good amylaseproducing material for the further industrial utilization.

Key words Amylase；Hydrolysis circle；Enzyme activity；Condition of enzyme production

基金項目 國家級“大學生創新創業計劃”（201610670040），貴州省教育廳普通高等學校創新團隊項目（黔教合人才團隊字〔2015〕68），黔南民族師范學院一流培育學科建設項目（2017年生物學學科），貴州省教育廳本科教學工程項目（黔教高發（2015）337號）。

作者簡介 文狄（1985-），女，湖南湘鄉人，副教授，博士，從事昆蟲發育與遺傳研究。

收稿日期 2018-05-12；修回日期 2018-05-18

淀粉酶是一類具有生物催化功能并且可以分解淀粉分子的生物酶。淀粉酶廣泛存在于動植物體以及各類微生物中，并且淀粉酶種類繁多，實用性強，可應用于日常的工農業生產、廢料的處理和微生態制劑等領域[1]。隨著科技的進步和生活水平的提高，社會生產對于淀粉酶的需求日益增加，因此在淀粉酶生產的各個過程中，選擇適合的能產生高活性淀粉酶的菌株是我們進行淀粉酶生產的關鍵[2]。該研究從土壤中分離純化出能產生高活性淀粉酶的菌株，并從不同碳源、氮源、溶氧量、CaCl2·2H2O濃度、溫度和pH等方面對其產酶條件進行研究，通過對菌株產生的淀粉酶的酶學條件進行分析和整理，以期獲得更經濟、實用性更強的高活力淀粉酶[3]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣采集。

采取校園內綠化草坪、花壇、小樹林、實驗樓后山、都勻市郊外、菜園、河邊等不同生境的土樣共23份，量取5～10 cm深土層土壤，置于4 ℃的冰箱保存，作為篩選菌株的材料備用。

1.1.2 培養基。

（1）天然培養基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂粉15～20 g/L，可溶性淀粉10 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0～7.2（用1 mol/L鹽酸或氫氧化鈉調節），121 ℃滅菌30 min。

（2）分離平板培養基：可溶性淀粉4 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨5 g/L，NaCl 5 g/L，KH2PO4 1 g/L，瓊脂12 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 6.0，121 ℃滅菌30 min。

（3）種子培養基：可溶性淀粉10 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨5 g/L，KH2PO4 2 g/L，水1 000 mL，pH 6.0，121 ℃滅菌30 min。

（4）產酶液體培養基：可溶性淀粉10 g/L，酵母膏10 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L，KH2PO4 2 g/L，CaCl2·2H2O 質量分數為0.05%，MgSO4·7H2O質量分數為0.05%，FeSO4·7H2O質量分數為0.05%，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0，121 ℃滅菌30 min。

（5）碘液：碘 1 g，碘化鉀 2 g，加蒸餾水定容至300 mL。

（6）檸檬酸緩沖液，pH 6.0。

1.1.3 試驗試劑。

試劑均為市售分析純生化試劑。

1.1.4 試驗儀器。

自動壓力蒸汽滅菌器（廈門致微儀器有限公司）；電熱恒溫干燥箱使用說明書（北京科偉永興儀器有限公司）；S系列超凈工作臺（適用：VS-840K、VS-840K-U、VS-13000L、VS-1300L-U、HS-840、 HS-840-U、HS1300、HS-1300-U。北京安泰空氣技術有限公司）；ZXDP系列曲線控制恒溫培養箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；電冰箱（青島海爾股份有限公司）；HC-2517高速離心機（安徽中科科學儀器有限公司）冰箱。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種篩選。

初篩：稱量5 g土樣，放入裝有45 mL無菌水的三角瓶里，搖床20 min使土樣分散均勻，靜置5 min后再進行濃度梯度稀釋，分別用移液槍量取10-5、10-6、10-7 濃度下的土樣稀釋液1 mL于滅菌平板上[4-5]，并用玻璃涂布棒涂布均勻，凝固后置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h。菌體生長后滴加碘液，若有透明圈出現，表明淀粉被水解，即該菌株能產生胞外淀粉酶。

純化：挑選有明顯水解圈的細菌，在牛肉膏蛋白胨培養基中劃線分離，37 ℃培養24 h；重復上述操作，直至產生單菌落。

復篩：將純化后的菌株轉接到試管斜面，37 ℃培養24 h分別再點種到分離培養基上培養，菌體長成后再滴加碘液并比較水解圈大小，挑選水解圈直徑（D）與菌落直徑（d）比值大于2.5的6株形態較好的菌落作為該試驗的出發菌株，并記錄二者比值的大小。

1.2.2 淀粉酶活力測定。

發酵液在37 ℃、180 r/min培養24 h，5 000 r/min離心10 min后，取上清液即為粗酶液。

取5 mL 0.5%可溶性淀粉溶液，37 ℃水浴10 min，再加入0.5 mL適當稀釋的粗酶液，混勻，37 ℃準確反應10 min后冰浴中終止反應。與碘液作用顯色后測定在660 nm波長時的吸光度（A）值。測定結果根據淀粉標準曲線換算成淀粉濃度，以所測定條件下的最高活力為1，其他樣品用最高活力校正為相對酶活力[6]。

1.2.3 菌種鑒定。

根據《伯杰細菌鑒定手冊》鑒定細胞形態。細菌分子學鑒定利用16S rDNA的序列比對，首先提取細菌總DNA[7]，用16S rDNA通用引物F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和 R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′PCR擴增[3]；PCR擴增條件為95 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，循環29次。擴增產物經DNA純化回收后，送上海生工生物工程股份有限公司測序。將16S rDNA測序結果在NCBI上進行Blast，分析序列相似性，鑒定菌株種類。

1.2.4 不同碳源對菌株產酶的影響。

取出發菌株活化后接入種子培養基中培養24 h，再按1%接種量接種到不同碳源配制的產酶培養基中，37 ℃、180 r/min培養24 h，取粗酶液離心并測酶活，以確定最適碳源。

1.2.5 不同氮源對菌株產酶的影響。

取出發菌株活化后接入種子培養基中培養24 h，再按1%接種量接種種子到不同氮源配制的產酶培養基中，37 ℃、180 r/min培養24 h，取粗酶液離心并測酶活以確定最適氮源[8]。

1.2.6 培養基最適發酵pH的確定。

取出發菌株活化后接入種子培養基中培養24 h，再按1%接種量接種種子到pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和100的產酶培養基中，37 ℃、180 r/min培養24 h，取粗酶液離心并測酶活以確定最適初始pH[8]。

1.2.7 最適培養溫度的確定。

取出發菌株活化后接入種子培養基中培養24 h，再按1%接種量接種種子到產酶培養基中，分別在27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47 ℃下培養24 h，取粗酶液離心并測酶活，以確定最適初始pH。

1.2.8 培養基溶氧量對菌株產酶的影響。

取出發菌株活化后接入種子培養基中培養24 h，再按1%接種量接種種子到產酶培養基中，分別裝入培養基20、25、30、35、40、45和50 mL于250 mL三角瓶，37 ℃、180 r/min培養24 h，取粗酶液離心并測酶活以確定最適溶氧量[8]。

1.2.9 CaCl2·2H2O濃度對菌株產酶的影響。

向產酶培養基中加入質量濃度依次為0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%的CaCl2·2H2O，37 ℃、180 r/min培養24 h，取粗酶液離心并測酶活以確定最適CaCl2·2H2O濃度。

1.2.10 酶反應最適pH的確定。

用pH為4.0、4.5、5.0、55、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5和10.0的檸檬酸緩沖溶液配制可溶性淀粉溶液，取粗酶液離心并在不同pH條件下測酶活，以確定酶反應的最適pH[8]。

1.2.11 酶反應最適溫度的確定。

取在已優化條件下培養獲得的粗酶液離心，在27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47 ℃不同溫度下測酶活，以確定酶反應的最適溫度。

2 結果與分析

2.1 產胞外淀粉酶的初篩

從所有土樣中共篩選到44株能水解淀粉的細菌，在篩選平板上均能產生明顯的水解圈，分別將這44株細菌編號Z1～Z44，并接種到斜面試管培養后低溫保存[8]。其中Z3菌株在平板上產生的水解圈如圖1所示。

2.2 產胞外淀粉酶的復篩

將所有純化后的菌種分別點種培養，再向菌落上噴灑碘液，比較水解圈的大小，挑取水解圈直徑（D）與菌落直徑（d）比值大于2.50的6株菌株（表1）進行3次點種培養，選擇直徑比最大的Z3菌株作為出發菌株[9]。菌株在平板上產生的水解圈如圖1所示。

2.3 Z3菌株的鑒定

2.3.1 Z3菌株的形態學鑒定。Z3菌株革蘭氏陽性，細胞呈桿狀，無莢膜，有明顯的芽孢（圖2、3）。

2.3.2 Z3菌株的分子學鑒定。

16S rDNA 序列是細菌鑒定的重要指標，利用PCR擴增Z3菌株的16S rDNA序列，并用NCBI的Blast進行核苷酸同源性比對，結果表明Z3菌株為蠟狀芽胞桿菌（Bacillus cereus）。

2.4 液體發酵培養基的優化

為優化發酵條件，對Z3菌株的發酵培養基碳源、氮源的種類、發酵培養基的初始pH、發酵溫度、溶氧量和Ca2+進行考察，以確定Z3菌株的最佳產酶條件。

2.4.1 碳源對Z3菌株產酶的影響。

以1%蛋白胨為氮源，用不同碳源配制產酶液體培養基培養菌株Z3，37 ℃、180 r/min培養24 h，取粗酶液離心并測酶活。結果如圖4所示，以質量分數為1%的可溶性淀粉作為碳源時，Z3菌株酶活力最高，定義為1，相對酶活從高到低，依次是1%麥芽糖、1%乳糖、1%蔗糖、1%葡萄糖，相對酶活分別為0.84、0.81、078、076。

2.4.2 氮源對Z3菌株產酶的影響。

以1%可溶性淀粉為碳源，用不同氮源配制產酶液體培養基培養菌株Z3，37 ℃、180 r/min培養24 h，取粗酶液離心并測酶活[9]。結果如圖5所示，以1%酵母膏+1%牛肉膏作為氮源時菌株Z3酶活力最高。

2.4.3 溶氧量對Z3菌株產酶的影響。

在不同的溶氧條件下培養Z3菌株，37 ℃、180 r/min培養24 h，取粗酶液離心并測定不同溶氧條件下的酶活。結果如圖6所示，250 mL搖瓶中裝液量為30 mL時為最佳溶氧量，其后依次為裝液量為50、40、45、35、25、20 mL。整體趨勢為隨著裝液量的增加，單位體積的粗酶液相對酶活力逐漸增大，當裝液量達到30 mL/250 mL時酶活力達到峰值，然后稍有下降，并趨于平穩。

2.4.4 CaCl2·2H2O濃度對Z3菌株產酶的影響。

向產酶培養基中加入不同質量濃度的CaCl2·2H2O，對Z3菌株進行發酵產酶試驗，然后進行粗酶液酶活測定。結果圖7所示，隨著CaCl2·2H2O濃度的增加，Z3菌株產酶相對活力逐漸升高，到達峰值之后，稍有下降，其后趨于穩定，其中當CaCl2·2H2O濃度為0.2%時，單位體積粗酶液相對酶活最高，其后依次是0.6%、0.4%、1.0%、0.8%、0%，其相對酶活分別為087、0.82、0.81、0.77、0.61。

2.4.5 培養基初始pH對Z3菌株產酶的影響。

將已優化的產酶培養基pH設置為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，接種Z3菌株，37 ℃、180 r/min培養24 h，測定以上pH情況下Z3菌株產淀粉酶的相對酶活力，結果如圖8所示。當pH范圍從4.0逐漸增大到7.0時，Z3菌株粗酶液相對酶活力逐漸增加；當pH達到7.0時，相對酶活力達到峰值；當pH繼續增加，從7.0到10.0時，Z3菌株粗酶液相對酶活力逐漸降低。以上數據表明，Z3菌株發酵最佳pH為7.0，呈中性。

2.4.6 培養溫度對Z3菌株產酶的影響。

將Z3菌株置于27、29、31、33、35、37、39、41、43、45和47 ℃溫度下培養，180 r/min培養24 h，測定不同溫度培養條件下Z3菌株粗酶液的酶活力，結果如圖9所示。當溫度從27 ℃上升到37 ℃時，Z3菌株粗酶液的相對酶活力逐漸增強；培養溫度在37 ℃，Z3菌株粗酶液的相對酶活力最高。當溫度從37 ℃繼續上升到47 ℃時，Z3菌株粗酶液的相對酶活力逐漸減小；試驗數據表明，Z3菌株發酵最適溫度為37 ℃。

2.5 Z3菌株所產淀粉酶的酶學性質

2.5.1 酶反應的最適pH。

將Z3菌株在產酶培養基中，37 ℃，180 r/min培養24 h，再用pH為4.0、4.5、5.0、5.5、60、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0的檸檬酸緩沖液配制可溶性淀粉溶液，取粗酶液離心并測相對酶活。結果如圖10所示，當酶反應的pH在4.0到8.0范圍內，隨pH的升高，相對酶活力逐漸增強；在pH為8.0時，Z3菌株淀粉酶相對酶活力達到峰值；當酶反應的pH在8.0～10.0范圍內，隨pH的繼續上升，相對酶活力逐漸減弱；以上數據表明，Z3菌株所產淀粉酶為偏堿性淀粉酶。

2.5.2 酶反應的最適溫度。

將Z3菌株在37 ℃、180 r/min培養24 h，分別在27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47 ℃不同溫度下測菌株Z3所產胞外淀粉酶的相對酶活力。結果如圖11所示，在27～39 ℃時，隨反應溫度的升高，相對酶活逐漸增強；當反應溫度在39 ℃時，相對酶活最高；在39～47 ℃時，隨反應溫度的升高，相對酶活力逐漸減弱。數據表明，Z3所產胞外淀粉酶最佳反應溫度為39 ℃。

3 結論與討論

該研究通過淀粉水解圈平板篩選法，從都勻市不同地點采集到23份土樣中，分離到44株產胞外淀粉酶的細菌，并通過復篩從6株水解圈/菌落直徑比相對較大的菌株中篩選得到一株產淀粉酶活力較高的菌株Z3，其水解圈/菌落直徑比達5.5。通過檢測相對酶活力，對Z3菌株產酶條件進行研究，結果顯示：培養基Z3菌株產酶最適碳源為1.0%淀粉；氮源

為1.0%酵母膏+1.0%牛肉膏；最適溶氧量為250 mL搖瓶裝30 mL培養基；最適CaCl2·2H2O濃度為0.2%的CaCl2·2H2O；最佳培養基pH為7.0；培養最佳溫度為37 ℃。此外，該研究還對菌株Z3所產淀粉酶的酶學性質進行初步研究，數據顯示其最適酶反應pH為8.0，但在pH 10.0的強堿性環境仍具有相對較高的酶活；其最適酶反應溫度為39 ℃，且在27～47 ℃的較寬溫度條件下均具有一定酶活，表明Z3菌株

所產淀粉酶為偏堿性且適溫性較廣，可以作為工業生產進一步開發利用。

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