液相色譜—串聯質譜法快速檢測豬肉中25種β—受體激動劑

胡佳哲 梁賢凱 賴宇紅

摘要 [目的]建立液相色譜-串聯質譜法快速同時測定豬肉中克倫特羅、西馬特羅、溴代克倫特羅、馬布特羅、羥甲基克倫特羅、溴布特羅、福莫特羅、馬賁特羅、苯氧丙酚胺、拉貝特羅、氯丙那林、沙丁胺醇、苯乙醇胺A、妥布特羅、特布他林、萊克多巴胺、菲諾特羅、克倫塞羅、齊帕特羅、克倫潘特、克倫特羅、西布特羅、班布特羅、丙卡特羅、沙美特羅25種β-受體激動劑的分析方法。[方法]樣品經0.2 mol/L磷酸-甲醇（1∶1）提取，Bond ElutPlexa PCX小柱凈化，Thermo Accucore Phenyl Hexyl（2.6 μm，100 mm×2.1 mm）色譜柱分離，電噴霧正離子模式測定，內標法定量。[結果]25種β-受體激動劑在2.5～100.0 μg/L呈良好線性關系，決定系數R.2均大于0.990，在豬肉中的檢出限為0.2～1.2 μg/kg，在2.5、5.0和10.0 μg/kg 3個加標水平下的回收率為83.70%～112.20%，RSD為0.18%～10.10%。[結論]該方法前處理簡單、靈敏度高、適用性好，可用于批量豬肉中25種β-受體激動劑的快速確證分析。

關鍵詞 液相色譜-串聯質譜；β-受體激動劑；快速檢測；豬肉

中圖分類號 S851.34.+7 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）23-0155-06

Abstract [Objective] The research aimed to establish a method of rapid simultaneous determination of clenbutero，cimaterol，bromchlorbuterol，mabuterol，hydroxymethylclenbuterol，brombiterol，formoterol，mapenterol，tsoxsuprine，labeiterol，clorprenaline，salbutamol，phenylethanolamineA，tulobuterol，terbutalin，ractopamine，fenoterol，clencyclohexerol，zilpaterol，clenpenterol，clenbuterol，cimbuterol，bambuterol，procaterol，salmeterol twentyfive kinds of beta receptor agonists by liquid chromatographytandem mass spectrometry.[Method]The sample was extracted by 0.2 mol/L phosphatemethanol （1：1），and the extracts were purified by Bond Elut Plexa PCX，after being eluted from the cleanup column，the analytes were separated on a Thermo Accucore Phenyl Hexyl （2.6 m，100 mm x 2.1mm） column and detected by electrospray mass spectrometry in positive ionization mode with multiple reaction monitoring.The method was quantitatively detected by internal standard method.[Result]The linear ranges of twentyfive kinds of betareceptor agonist were in the range of 2.5-100.0 μg/L with correlation coefficients higher than 0.990.The limits of detection（LOD） were 0.2-1.2 μg/kg.The recoveries of 2.5，5.0 and 10.0 μg/kg was 83.70%-112.20%，and the relative standard deviation （RSD） was 0.18-10.10%.[Conclusion] This method is simple，sensitive and applicable，and can be used for the rapid confirmation analysis of twentyfive kinds of betareceptor agonist in pork.

Key words Liquid chromatographytandem mass spectrometry；Betareceptor agonist；Rapid detection；Pork

β-受體激動劑，俗稱瘦肉精，是具有苯乙醇胺結構的腎上腺素類合成藥物[1]。在臨床上，β-受體激動劑可以放松支氣管平滑肌，增加纖毛運動頻率，調節黏膜纖毛的清除率，可以用于治療支氣管炎和哮喘等疾病[2-3]。這類藥物結構中的活性基團，在動物體內能結合組織細胞膜中的β-受體，從而發生一系列生理效應，可以促使平滑肌擴張，增加肺活量，同時干擾胰島素的釋放，加快體內糖原和脂肪的分解[4]。在動物飼養過程使用這類藥物，可提高飼料的轉化率，達到營養再分配的作用，進而明顯提高動物的瘦肉率[5]。β-受體激動劑類藥物有較強的蛋白質同化作用，殘留的瘦肉精通過食物鏈會被人體吸收進而造成人體中毒。人食用有瘦肉精殘留的食物后，會出現肌肉振顫、心慌、戰栗、頭疼、惡心、嘔吐等癥狀[6]，對于患有高血壓、心臟病、甲亢和前列腺肥大等疾病的人影響和危害更大，嚴重者可危及生命[7]。

目前，關于β-受體激動劑類藥物殘留檢測方法大多采用液相色譜-串聯質譜法（LC-MS）[8-17]，多數選擇酶解、酸化水溶液提取、堿化有機溶劑提取、陽離子交換固相萃取凈化，步驟操作繁瑣，費時，干擾因素多。針對我國消費量較大的豬肉，構建前處理快速簡便、能同時測定20余種β-受體激動劑的LC-MS檢測方法，以有效控制動物源性食品中該類藥物的殘留量具有十分重要的現實意義。筆者采用酸化提取并通過Bond Elut Plexa PCX固相萃取凈化的預處理，液相色譜-串聯質譜技術進行分離檢測，快速測定和分析豬肉中25種β-受體激動劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器。LC-20ADXR/四元梯度泵高效液相色譜（日本Shimadzu 公司）；TripleQuad5500三重四極桿質譜檢測系統（美國AB SCIEX 公司）；Thermo X1R低溫高速離心機（美國Thermo公司）；多功能渦旋混合器（Talbous公司）；HY-2A調速多功能振蕩器（江蘇常州澳華儀器有限公司）；Labtech MV5自動氮吹儀（LabTech公司）；KQ-500DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q 超純水儀（美國Millipore 公司）。

1.1.2 主要試劑?？藗愄亓_、西馬特羅、溴代克倫特羅、馬布特羅、羥甲基克倫特羅、溴布特羅、富麻酸福莫特羅、馬賁特羅、苯氧丙酚胺、拉貝特羅、氯丙那林、沙丁胺醇、苯乙醇胺A、托布特羅、特布他林、萊克多巴胺、菲諾特羅、克倫塞羅、齊帕特羅、克倫潘特、克倫特羅、西布特羅、班布特羅、丙卡特羅、沙美特羅、沙丁胺醇-D3、克倫特羅D9標準品，購自德國Dr.Ehrensorfer公司；均質子、Bond Elut Plexa PCX小柱（200 mg，6 mL），均購自美國Aligent公司；甲醇、乙腈試劑，均產自美國Merck公司，均為色譜純；甲酸試劑，產自美國Fluka公司，色譜純；其他未作特殊說明的試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液的制備。

1.2.1.1 25種β-受體激動劑儲備溶液。準確稱取各標準品10.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶，配制成1.0 mg/mL的單標標準儲備溶液，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.1.2 25種β-受體激動劑混合標準工作液。分別移取適量的單標儲備液，用甲醇逐級稀釋成濃度為1.0 mg/L的25種β-受體激動劑混合標準工作液，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.1.3 內標儲備溶液。準確稱取沙丁胺醇-D3和克倫特羅-D9各10.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶，配制成1.0 mg/mL的單標標準儲備溶液，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.1.4 內標混合標準工作液。分別移取適量的內標單標儲備液，用甲醇逐級稀釋成濃度為50 ng/mL的內標混合標準工作液，置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 供試品溶液的制備。稱取2.0 g均質樣品于50 mL離心管中，加入100 μL混合內標工作液（濃度為50 ng/mL），渦旋混勻，加入一枚均質子和0.2 mol/L磷酸-甲醇（1∶1）10 mL，水平振蕩20 min，在4 ℃、10 000 r/min離心5 min。將上清液轉移至另一離心管中，殘渣用0.2 mol/L磷酸10 mL再提取1次，合并2次上清液，在4 ℃、10 000 r/min離心5 min，取上清液備用凈化。

Bond Elut Plexa PCX小柱（200 mg，6 mL），依次用5 mL甲醇和5 mL水活化，將上述待凈化液加入小柱中，待流干，依次用5 mL水和5 mL甲醇淋洗，棄掉，用5 mL 5%氨水甲醇洗脫，收集流出液。將流出液在50 ℃下氮氣吹至近干，用2 mL 0.1%甲酸-甲醇（9∶1）復溶，充分溶解，過0.22 μm濾膜，供液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.2.3 儀器分析條件。

1.2.3.1 液相色譜條件。色譜柱為Thermo Accucore Phenyl Hexyl（2.6 μm，100 mm×2.1 mm）；流速為0.3 mL/min；柱溫為40 ℃；流動相A為0.1%甲酸水（含5 mmol/L乙酸胺），流動相B為0.1%甲酸乙腈。洗脫梯度：0～1.0，5%B；1.0～3.5，5%～35%B；3.5～6.0，35%～80%B；6.0～8.0，80%B；8.0～8.1，80%～5%B；8.1～10.0，5%B。

1.2.3.2 質譜條件。電噴霧離子源（ESI），多反應監測（MRM），正離子模式；噴霧電壓5.5 kV；氣簾氣壓力0.24 MPa；碰撞氣壓力0.02 MPa；溫度500 ℃；碰撞室入口電壓10 V；碰撞室出口電壓12 V；駐留時間50 ms；離子源Gas1和Gas2均為0.50 MPa。其他參數見表1。

1.2.4 方法學考察。

1.2.4.1 標準曲線的繪制。將25種β-受體激動劑混合標準溶液按比例配制為2.5、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL（內標物濃度均為2.5 ng/mL）6個濃度，按照“1.2.3”儀器分析條件測定，每次進樣10 μL，以對照品濃度（ng/mL）為橫坐標、外標峰面積與內標峰面積比值R為縱坐標繪制標準曲線，計算線性回歸方程。

1.2.4.2 檢出限的考察。將25種β-受體激動劑混合標準溶液逐步稀釋后進樣測定，以色譜圖中信噪比（S/N）為3時的進樣量為最低檢測限（LOD）。

1.2.4.3 加樣回收試驗和精密度試驗。選擇陰性豬肉樣品，精密添加適當的25種β-受體激動劑混合標準溶液，考察低（2.5 μg/kg）、中（5.0 μg/kg）、高（10.0 μg/kg）3個濃度水平的回收試驗，混合均勻后，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，再按“1.2.3”儀器分析條件測定，進樣量為10 μL，每個加標水平平行測定6次，測定外標峰面積與內標峰面積比值R，計算平均回收率和精密度（RSD）。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化 質譜優化采用微量進樣泵連續進樣的方式，分別對濃度為50 ng/mL的克倫特羅、西馬特羅、溴代克倫特羅、馬布特羅、羥甲基克倫特羅、溴布特羅、富麻酸福莫特羅、馬賁特羅、苯氧丙酚胺、拉貝特羅、氯丙那林、沙丁胺醇、苯乙醇胺A、妥布特羅、特布他林、萊克多巴胺、菲諾特羅、克倫塞羅、齊帕特羅、克倫潘特、克倫特羅、西布特羅、班布特羅、丙卡特羅和沙美特羅的標準溶液進行一級質譜掃描，確定各個組分準分子離子，優化噴霧電壓、離子源溫度、脫溶劑溫度、氣簾氣、霧化氣、輔助加熱氣條件，使25種β-受體激動劑母離子綜合響應強度達到最佳。將獲得的母離子進行二級質譜掃描，分別優化25種β-受體激動劑的碎片離子，對去簇電壓、碰撞能量、碰撞室射出電壓進行優化，選擇豐度較高的2個碎片離子作為定量和定性離子。

2.2 色譜條件的優化 大多數β-受體激動劑類的色譜分離采用0.1%甲酸溶液和甲醇或乙腈組成的混合溶液作為流動相，試驗用0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸水作為流動相時，發現菲諾特羅、苯乙醇胺A、丙卡特羅、沙美特羅的離子化程度不好，在水系流動相中添加少許乙酸銨，上述情況得到明顯改善，保證測定靈敏度的同時，化合物之間的分離度也得到進一步改善。試驗比較了0.1%甲酸水溶液（含5 mmol/L乙酸胺）和0.1%甲酸水溶液（含10 mmol/L乙酸胺）作為流動相，發現分離度與回收率并沒有隨著乙酸胺濃度升高而增高，因此最終選擇0.1%甲酸水（含5 mmol/L乙酸胺）和0.1%甲酸乙腈作為流動相。

2.3 提取溶劑的選擇 水解主要包括酸解和酶解，酶制劑本身及其水解的樣品往往可產生大量的干擾物質，且酶解條件受酶種類、樣品基質及水解條件不同而有所不同，而酸解的分析結果與酶解相近，且產生的干擾物質較少，該研究采用酸解的方式進行水解。結合25種β-受體激動劑不同的極性，最后確定0.2 mol/L磷酸與甲醇同比例混合溶液進行水解提取。

2.4 固相萃取柱的選擇 由于動物源性食品中的基質成分復雜，即使經過0.2 mmol/L磷酸-甲醇（1∶1）提取后，提取液中含有很多雜質干擾目標物在儀器上的響應。所以該試驗采用固相萃取小柱對提取液進一步的凈化和富集，并比較了常用的中性氧化鋁小柱、HLB小柱、硅膠小柱和PCX小柱等4種固相萃取小柱對25種β-受體激動劑的凈化效果，以25種待測物的平均加標回收率作為比較依據。結果發現，相比較其他幾款小柱，PCX小柱對樣品提取液的凈化效果好，加標回收率最高。主要是因為在酸性條件下，PCX小柱能夠吸附具有一定弱堿性的β-受體激動劑，淋洗液淋洗雜質后，再用堿性有機溶劑進行洗脫，洗脫液較為干凈，雜質少，能對提取液起到很好的凈化效果。

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系和檢出限的考察。按“1.2.4.1”和“1.2.4.2”方法操作，以β-受體激動劑的濃度為橫坐標、相應組分的峰面積與內標物峰面積的比值為縱坐標，進行內標法校正，25種β-受體激動劑的線性結果見表2，決定系數R.2均大于0.990。以特征離子信噪比S/N>3對應的濃度為檢出限，各待測物的檢出限為0.2～1.2 ng/mL，方法的靈敏度完全滿足國家標準對β-受體激動劑的限量檢測要求。

2.5.2 回收試驗和精密度的考察。按“1.2.4.3”方法操作，計算平均回收率和精密度（表3），色譜圖如圖1～3所示。從表3可看出，25種待測物的回收率為83.70%～112.20%，相對標準偏差（RSD）為0.18%～10.10%。表明該方法準確、可靠，精密度良好，可用于豬肉等動物源性食品中多種β-受體激動劑殘留的檢測。

3 結論

該研究建立了豬肉中25種β-受體激動劑的固相萃取凈化/液相色譜-質譜的快速檢測方法。試驗優化了色譜條件和質譜參數，優選出0.2 mol/L磷酸與甲醇同比例混合溶液提取和Bond Elut Plexa PCX凈化體系。方法學評價結果表明，25種β-受體激動劑在2.5～100.0 ng/mL呈良好線性關系，決定系數R.2均大于0.990，在豬肉中的檢出限為0.2～1.2 μg/kg。通過添加2.5、5.0和10.0 μg/kg的3個濃度水平回收試驗，發現25種β-受體激動劑的回收率為83.70%～112.20%，RSD為0.18%～10.10%。該方法前處理簡單、靈敏度高、適用性好，適用于大批量樣品的快速篩選和定量測定，為快速監測豬肉乃至動物源性食品中禁用β-受體激動劑類物質的殘留情況，提高監管和產品質量提供技術支持。

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