霍山石斛多糖的半仿生提取工藝優(yōu)化與抗炎活性評(píng)價(jià)

戴瑋 羅建平

摘要 [目的]優(yōu)化霍山石斛多糖的半仿生提取工藝，并評(píng)價(jià)所提多糖的抗炎活性。[方法]以多糖得率為指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)方法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以L(fǎng)PS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞為體外炎癥模型，評(píng)價(jià)多糖的抗炎活性。[結(jié)果]半仿生提取法最佳工藝條件為：料液比1∶30、提取溫度80 ℃、模擬胃液提取時(shí)間1.5 h、模擬腸液提取時(shí)間 2.5 h，在此條件下多糖的得率為（60.9±1.2） mg/g，較傳統(tǒng)水提法的多糖得率提高16.55%。細(xì)胞試驗(yàn)表明，霍山石斛多糖能抑制RAW264.7細(xì)胞NO及IL-1β的分泌，降低iNOS和IL-1β mRNA的表達(dá)。[結(jié)論]優(yōu)化后的提取工藝合理可行，提取率高，所提多糖的抗炎活性?xún)?yōu)于傳統(tǒng)方法制備的多糖。

關(guān)鍵詞 霍山石斛多糖；半仿生提取法；抗炎活性

中圖分類(lèi)號(hào) S-3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）23-0151-04

Abstract [Objective]The semibionic extraction technology of Dendrobium huoshanense polysaccharides was optimized and the antiinflammatory activity of polysaccharides was evaluated.[Method]Single factor and orthogonal experiments were used to optimize the extraction technology based on polysaccharide yield.LPSinduced RAW264.7 macrophages were used to determine the antiinflammatory activity of polysaccharides.[Result]The optimal conditions of semibionic extraction were solidliquid ratio of 1∶30，extraction temperature of 80 ℃，stimulated gastric fluid extraction time of 1.5 h and simulated intestinal fluid extraction time of 2.5 h.Under the optimized conditions，the yield of polysaccharides was （60.9±1.2 ）mg/g，which was increased by 16.55% as compared to the traditional water extraction technology.Cell experiments showed that the polysaccharides obtained by semibionic extraction technology could effectively inhibit the secretion of NO and IL1β from RAW264.7 cells and reduce the mRNA expression of iNOS and IL1β in RAW264.7 cells.[Conclusion] The optimized technology is reasonable and feasible，its extraction ratio is high，and the extracted polysaccharides from Dendrobium huoshanense has better antiinflammatory activity than that of the polysaccharides prepared by water extraction.

Key words Dendrobium huoshanense polysaccharides；Semibionic extraction；Antiinflammatory activity

霍山石斛是安徽省特有的傳統(tǒng)名貴中藥材，藥食兩用歷史悠久。大量研究表明，多糖是霍山石斛的主要活性成分，對(duì)與高血糖、高血壓、高血脂、肥胖癥、脂肪肝等慢性代謝性疾病相關(guān)的炎性免疫具有調(diào)節(jié)功能[1-2]，可有效改善身體健康狀況。植物多糖提取多采用水提醇沉法，提取耗時(shí)且提取率不高[3]。采用半仿生提取法提取霍山石斛多糖，不僅具有生產(chǎn)成本低、易于放大、操作過(guò)程綠色安全等優(yōu)點(diǎn)，而且提取的多糖符合霍山石斛的使用習(xí)慣，可為霍山石斛的開(kāi)發(fā)和利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與主要試劑?；羯绞蚯o由合肥工業(yè)大學(xué)中草藥與功能食品研究所提供。胎牛血清（北京索萊寶科技有限公司）、0.25%胰蛋白酶溶液、青霉素鏈霉素溶液-雙抗（GIBCO公司）、DMEM培養(yǎng)基（Thermo Fisher 公司）、cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo公司）、Mouse IL-1β試劑盒（上海源葉生物科技有限公司）、NO試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。其余試劑均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器。Hei-VAP Advantage旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國(guó)Heidolph公司）；SHZ-D循環(huán)水式真空泵（鞏義市英予華儀器廠）；CT15RT高速冷凍離心機(jī)（上海天美科學(xué)儀器有限公司）；1260 Infinity高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；Vl100可見(jiàn)光分光光度計(jì)（上海美普達(dá)儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 霍山石斛多糖半仿生法提取工藝的優(yōu)化。

1.2.1.1 單因素試驗(yàn)。

精密稱(chēng)取霍山石斛粉末1.0 g，在不同料液比、提取溫度和提取時(shí)間下用模擬胃液提取[4]，提取液離心，上清液為模擬胃液提取液，沉淀溶于模擬腸液[4]，在不同料液比、提取溫度和提取時(shí)間下提取，提取液離心取上清，得到模擬腸液提取液。當(dāng)考察單因素對(duì)多糖得率的影響時(shí)，其余因素固定，固定條件為：料液比1∶30、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間1.5 h。分別選取料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，提取溫度40、50、60、70、80、90、100 ℃，提取時(shí)間1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h進(jìn)行單因素試驗(yàn)。多糖含量采用苯酚-硫酸法測(cè)定，多糖得率（mg/g）以干重材料提取的多糖質(zhì)量表示。

1.2.1.2 正交試驗(yàn)。設(shè)置因素水平編碼表，利用設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)研究料液比（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）3個(gè)因素對(duì)各個(gè)指標(biāo)的影響。模擬胃液和模擬腸液提取正交試驗(yàn)因素水平編碼分別見(jiàn)表1和表2。

1.2.1.3 霍山石斛多糖半仿生提取的應(yīng)用。

半仿生提取法：精密稱(chēng)取霍山石斛原球莖粉末1.0 g，溶解于30 mL模擬胃液中，在80 ℃條件下提取1.5 h，提取液離心，上清液為模擬胃液提取液，沉淀溶于30 mL模擬腸液中，在80 ℃條件下提取2.5 h，提取液離心取上清，得到模擬腸液提取液，合并提取液得到半仿生法提取液，測(cè)定并計(jì)算其多糖得率。

傳統(tǒng)水提法：精密稱(chēng)取霍山石斛原球莖粉末1.0 g，溶解于30 mL蒸餾水中，在100 ℃條件下提取2 h，提取次數(shù)2次，離心取上清液，得到霍山石斛水提法提取液，測(cè)定并計(jì)算其多糖得率。

1.2.2 霍山石斛多糖的理化性質(zhì)分析。

傳統(tǒng)水提法和半仿生提取法提取的霍山石斛粗多糖經(jīng)陰離子交換樹(shù)脂純化，分別得到傳統(tǒng)水提法制備的多糖（DHP-1）和半仿生提取法制備的多糖（DHP-2）。

采用高效凝膠滲透色譜法[5]檢測(cè)多糖的分子量。樣品濃度為5 mg/mL，上樣量為20 μL，色譜條件：Agilent 1260 Infinity系統(tǒng)，示差折光檢測(cè)器，TSK G5000 PWxl（7.8×300 mm）和TSK G4000 PWxl（7.8×300 mm）色譜柱，雙蒸水流動(dòng)相，柱溫30 ℃，流速0.5 mL/min。多糖的重均分子量和數(shù)均分子量由Agilent GPC軟件計(jì)算獲得。

多糖的特性黏度[η]用烏氏粘度計(jì)測(cè)定[6]，測(cè)定條件為：溫度（30.0±0.1）℃、樣品濃度1.0 mg/mL。

多糖的單糖組成采用PMP柱前衍生化HPLC法測(cè)定[7]，測(cè)定條件是：上樣量20 μL；色譜柱，Agilent XDB-C18柱（250 mm，4.6 nm，0.5 μm）；流動(dòng)相，乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液（20∶80，V/V）；流速，1 mL/min；柱溫，25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)，250 nm。

1.2.3 霍山石斛多糖的抗炎活性測(cè)定

1.2.3.1 霍山石斛多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞NO和IL-1β釋放的影響。

設(shè)置對(duì)照組、LPS組、LPS+不同多糖組，除對(duì)照組不加LPS外，其他組均加入終濃度為1 μg/mL的LPS溶液。細(xì)胞于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，先與多糖共培養(yǎng)2 h，再加入LPS培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)結(jié)束后，4 ℃、1 000 r/min離心10 min取上清培養(yǎng)液，分別用試劑盒測(cè)定NO和IL-1β含量，具體方法參照各試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作程序?？疾斓亩嗵菨舛葹?5、50、100、200、400 μg/mL，考察的細(xì)胞密度為1×10.5、5×10.5、1×10.6個(gè)/mL。

1.2.3.2 霍山石斛多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞iNOS和IL-1β mRNA表達(dá)的影響。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，調(diào)整

細(xì)胞密度為5×10.5個(gè)/mL后置于24孔板培養(yǎng)24 h，分別加入不同濃度多糖（終濃度分別為25、50、100、200、400 μg/mL）培養(yǎng)2 h，再加入終濃度為1.0 μg/mL的LPS，培養(yǎng)24 h后提取細(xì)胞RNA，用Thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以GAPDH為內(nèi)參采用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增。GAPDH引物是5-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3和3-CAAAGTTGTCATGGATGHACC-5，iNOS引物是5-CCCTTCCGAAGTTTCTGGCAGCAGC-3和3-GGCTGTCAGAGCCTCGTGGCTTTG-5，IL-1β引物是5-ACAGATGAAGTGCTCCTTCCA-3和3-GTCGGAGATTCGTAGCTGGAT-5。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性1 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火及聚合60 s，擴(kuò)增循環(huán)35次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0和Origin 9軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和作圖，所有試驗(yàn)至少重復(fù)3次。P<0.05表示差異顯著（*），P<0.01表示差異極顯著（**）。

2 結(jié)果與分析

2.1 半仿生提取工藝的優(yōu)化

模擬胃液提取單因素試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。當(dāng)固定提取溫度為60 ℃、提取時(shí)間為1.5 h時(shí)，料液比在1∶10～1∶50多糖得率呈先增大后減小的趨勢(shì)，料液比為1∶30時(shí)多糖得率最高（圖1a）。在料液比為1∶30、提取時(shí)間為1.5 h條件下，提取溫度在40～100 ℃，多糖得率隨著提取溫度的升高而逐漸增大，但80 ℃后有減小趨勢(shì)（圖1b）。當(dāng)料液比為1∶30、提取溫度為60 ℃時(shí)，多糖得率在提取時(shí)間為2.0 h時(shí)達(dá)到最大，其后呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)（圖1c）。

模擬胃液中料液比、提取溫度、提取時(shí)間的正交試驗(yàn)表明（表3），以多糖得率為優(yōu)化指標(biāo)，表中最優(yōu)組合為A3B2C1，極差分析所得的最優(yōu)組合為A2B2C1。對(duì)2種組合進(jìn)行驗(yàn)證，A2B2C1組多糖得率為54.702 mg/g，A3B2C1組多糖得率為53.427 mg/g。因此，選擇A2B2C1組，即料液比1∶30、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間1.5 h作為模擬胃液提取部分的最優(yōu)工藝條件。

模擬腸液提取單因素試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。在提取溫度為60 ℃、提取時(shí)間為1.5 h條件下，料液比在1∶10～1∶50多糖得率先上升后降低，當(dāng)料液比為1∶30時(shí)多糖得率高（圖2a）。當(dāng)固定料液比為1∶30、提取時(shí)間為1.5 h時(shí)，多糖得率隨提取溫度的升高而提高，至80 ℃時(shí)最大，隨后呈下降趨勢(shì)（圖2b）。在料液比為1∶3、提取溫度為60 ℃條件下，多糖得率在提取時(shí)間為2.5 h時(shí)最大（圖2c）。

模擬腸液中料液比、提取溫度、提取時(shí)間的正交試驗(yàn)表明（表4），表中第6組A2B3C1的多糖得率最高，而極差分析得到的最優(yōu)組合為A2B2C2。經(jīng)驗(yàn)證，A2B2C2組多糖得率為22.556 mg/g，A2B3C1組合的多糖得率為22.315 mg/g。因

此，選擇A2B2C2組合，即料液比1∶30、提取溫度80 ℃、提取時(shí)間2.5 h作為模擬腸液提取部分的最優(yōu)工藝條件。

采用上述優(yōu)化的模擬胃液和模擬腸液提取條件組成的半仿生提取法提取霍山石斛多糖，多糖的得率可以達(dá)到（60.9±1.2） mg/g，而傳統(tǒng)水提法的多糖得率僅僅為（42.9±1.3） mg/g，半仿生提取法較傳統(tǒng)水提法多糖得率提高了16.55%。

2.2 霍山石斛多糖的理化性質(zhì)分析

由表5可知，半仿生法提取的多糖（DHP-2）與傳統(tǒng)水提法提取的多糖（DHP-1）的數(shù)均分子量（Mn）相差不大，但DHP-2的重均分子量（Mw）要明顯高于DHP-1的重均分子量，表明DHP-2物理性質(zhì)與相對(duì)分子質(zhì)量大的多糖組分關(guān)系更大。2種多糖多分散性系數(shù)d值均不為1，且DHP-2的d值更大，說(shuō)明2種多糖都不是均一組分，DHP-2的多糖分子量分布更寬。單糖組成分析結(jié)果表明，DHP-1和DHP-2均含有甘露糖、葡萄糖和半乳糖，但它們的組成比例不同。可見(jiàn)半仿生法提取的多糖在理化性質(zhì)方面與傳統(tǒng)水提法提取的多糖差異明顯。

2.3 霍山石斛多糖抗炎活性的分析

2.3.1 霍山石斛多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞NO、IL-1β釋放的影響。LPS能刺激RAW264.7細(xì)胞過(guò)量分泌炎癥因子NO及IL-1β[8]。設(shè)置地塞米松（dex）為陽(yáng)性對(duì)照，當(dāng)DHP-1和DHP-2濃度在25～200 μg/mL時(shí)，多糖對(duì)NO和IL-1β的抑制率隨多糖濃度的增加而提高，當(dāng)多糖濃度為400 μg/mL時(shí)，多糖對(duì)NO和IL-1β的抑制率略微下降（圖3）。結(jié)果表明，半仿生法制備的多糖與傳統(tǒng)水提法制備的多糖均能抑制炎性因子NO及IL-1β的過(guò)量表達(dá)，相比而言，DHP-2抑制炎性因子分泌的效果要優(yōu)于DHP-1。

2.3.2 霍山石斛多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞iNOS、IL-1β mRNA表達(dá)的影響。

由圖4可知，當(dāng)DHP-1和DHP-2濃度在25～200 μg/mL時(shí)，iNOS和IL-1β的mRNA相對(duì)表達(dá)量隨著多糖濃度的升高而降低，當(dāng)多糖濃度為400 μg/mL時(shí)，iNOS和IL-1β的mRNA相對(duì)表達(dá)量略微增加。結(jié)果表明，半仿生提取法制備的多糖與傳統(tǒng)水提法制備的多糖在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)均能降低iNOS及IL-1β mRNA的表達(dá)量，相比而言，DHP-2抑制iNOS和IL-1β mRNA表達(dá)的效果要優(yōu)于DHP-1。

3 結(jié)論

半仿生法提取霍山石斛多糖，多糖得率為（60.9±1.2） mg/g，提取效率可比傳統(tǒng)水提法提高16.55%。由于提取工藝不同，半仿生法提取的多糖與傳統(tǒng)水提法提取的多糖具有不同的理化性質(zhì)，兩者的分子量分布和單糖組成比例不同。抗炎活性評(píng)價(jià)分析顯示，半仿生法提取的多糖與傳統(tǒng)水提法提取的多糖均能抑制RAW264.7細(xì)胞NO及IL-1β的分泌，降低iNOS和IL-1β mRNA的表達(dá)，但半仿生法提取的多糖其抗炎活性要優(yōu)于傳統(tǒng)水提法提取的多糖。結(jié)果表明，采用半仿生法提取霍山石斛多糖，不僅可以提高多糖得率，還可提高多糖的抗炎活性。

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